니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
ATPase 효소는 아데노신 삼인산에 저장된 자유 에너지를 활용하여 자발적으로 발생하지 않는 생체 내 다양한 엔더고닉 생화학 적 과정을 촉매합니다. 이 단백질은 물질 대사, 세포 분열, 환경 변화 및 운동에 대한 반응을 포함하여 세포 생활의 본질적으로 모든 측면에 중요합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 소분자 ATPase 억제제의 반높은 처리량 스크리닝에 적응된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합된 ATPase 분석법을 기술한다. 이 분석법은 심장 및 골격 근 myosin II의, 원리의 증거로, 2개의 액틴 기지를 둔 분자 모터 ATPases에 적용되었습니다. ATP의 가수분해는 분석에서 효소 반응에 의해 NADH의 산화에 결합된다. 먼저, ATPase에 의해 생성된 ADP는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생성된다. PK는 포스포네놀피루바트(PEP)의 전이를 병렬로 피루브화로 촉매한다. 그 후, 피루브산은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소되어 NADH의 산화를 병렬로 촉매합니다. 따라서, ATP 농도의 감소는 NADH 농도의 감소와 직접적으로 상관되며, 이는 NADH의 본질적인 형광에 대한 변화에 뒤따른다. PEP가 반응 시스템에서 사용할 수 있는 한, ADP 농도는 매우 낮게 유지되어 자체 제품에 의한 ATPase 효소의 억제를 피합니다. 또한 ATP 농도는 거의 일정하게 유지되어 선형 시간 코스를 생성합니다. 형광은 지속적으로 모니터링되어 데이터 품질을 쉽게 추정할 수 있으며 잠재적인 아티팩트(예: 복합 침전 또는 열 변화로 인한)를 필터링하는 데 도움이 됩니다.
서론
묘신은 진핵생물1,2에서액틴 세포골격의 필라멘트를 따라 방향운동을 생성하기 위해 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 가수분해하는 메카노케미컬 에너지 트랜스듀서이다. 그(것)들은 세포기관의 수송, 근육 수축 또는 세포골격 긴장의 생성과 같은 그들의 각종 세포내 기능에 구조적으로 그리고 운동적으로 적응한1,2. 상기 미오신 수퍼패밀리는 인간 게놈3,4에서~12개의 뚜렷한 묘신 클래스에 속하는 ~40개의 미오신 유전자로 나타난다. 미오신 클래스의 구성원은 여러 암, 신경 장애, 골격 근병증 및 비대성 심근병증5,6과같은 매우 다양한 장애 세트에서 다양한 역할을 한다. 이러한 분자 모터의 많은 생리적 및 병리학적 기능을 감안할 때, 다양한 조건에 대한 약물 표적으로 점점인식되고 있는 것은 놀라운 일이 아니다 7. 최근 새로운 미오신 억제제
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프로토콜
1. 재고 솔루션 및 시약 준비
- 증류수에서 결정성 DTT를 1000 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 디티오트레이톨(DTT) 스톡 용액을 준비한다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 증류수에서 결정성 ATP를 100 mM의 최종 농도로 용해시켜 ATP 스톡 솔루션을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
- 70 mM 3-(N-morpholino)를 함유하는 10x NADH 완충제를 준비하여 프로판설포닉산(MOPS), 10 mM MgCl 2, 0.9 mM 에틸렌 글리콜-비스(β-aminoethyl ether)-N,N,N,N,N′, N′, N′,테트라아세트산(EGTA) 및 3 mMNaN을준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 10 mM MOPS 및 0.1 mM EGTA를 포함하는 1x 미오신 완충액을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 DTT를 0.1 %의 최종 농도에 추가 (w / v %) 사용하기 전에 각각 1 ....
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결과
선별 실험에 사용되는 일반적인 플레이트 레이아웃 맵은 그림1에 나와 있습니다. 첫 번째 행과 마지막 행은 NADH 교정 및 양성 제어(각각 20 μM para-aminoblebbistatin, 0.5% DMSO)를 위해 예약되어 있습니다. 나머지 행(B~O)은 화합물의 억제 활성을 테스트하는 데 사용된다. 여기서, 15단계 직렬 1:2 희석은 DMSO에서 10 mM 화합물 농도로부터 시작하여 화합물 플레이트로부터 분석판으로 제조 및 이송되고, 따라서 가장 높은 최종 화합물 농도가 50 μM(0.5% DMSO)이 되도록 분석판상에 있다. 두 행은 하나의 화합물(48개의 데이터 포인트/복합)에 대한 용량 응답 곡선을 가져오는 데 사용됩니다. 플레이트 레이아웃 맵은 지정된 프로젝트의 특정 목표를 지원하도록 다시 설계할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 수의 화합물에 대한 단일 포인트 스크리닝 데이터를 얻는 것.......
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토론
프로토콜의 중요한 단계
음의 제어만 있는 여러 플레이트(억제제 없는 ATPase 반응)를 실행하여 플레이트 레이아웃을 최적화합니다. 반응 속도의 패턴을 신중하게 검사합니다. 예를 들어, 이들은 "비 바인딩"플레이트의 친수성 표면 코팅의 가장자리 효과 및 / 또는 결함에서 발생할 수 있습니다. 패턴이 관찰되면 아티팩트를 최소화하기 위해 플레이트 유형 및/또는 플레이트 레이아웃을 변경합니다. 예를 들어, 일반적인 투여량-응답 곡선(삼중분액이 있는 16농도, 총 48점)은 3개의 컬럼 또는 384웰 플레이트에 2열로 배열될 수 있다. 이러한 배열은 각각 6데이터와 4개의 데이터 포인트를 생성하며, 이는 에지 효과의 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 행 배열은 항상 바람직합니다.
수정 및 문제 해결
관찰된 형광 반응은 반응의 풀.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 약물 남용 NS096833 (CAM)에 대한 신경 장애 및 뇌졸중및 국립 연구소의 보조금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 384웰 로우 플랜지 블랙 플랫 바텀 폴리스티렌 NBS 마이크로플레이트 | Corning | 3575 | |
| ATP(아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB 디스펜서 | Aurora Discovery, Inc. | ||
| Biomek NXP 다채널 실험실 자동화 워크스테이션 | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | 맞춤형 합성 |
| BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 무료) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, 냉장, Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, 비냉장, Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | 시그마 | D2650 | |
| DTT (DL-디티오트레이톨) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip 멀티채널 피펫; 384-형식; 8-채널 | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip 멀티채널 피펫; 96-형식; 8-채널 | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N′-테트라아세트산) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 멀티라벨 플레이트 리더 | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| 글리세롤 | Sigma | G2025 | |
| LDH (토끼 근육에서 추출한 L-젖산 탈수소효소) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (염화마그네슘 육수화물) | 시그마 | M2670 | |
| 마이크로플레이트 셰이커 | VWR | 12620-926 | |
| 마이크로플레이트, 384 웰, PP, 소량, 딥 웰, 천연 | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)프로판설폰산) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (소 심장 근육) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐염 수화물) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (아지드화나트륨) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (수산화나트륨) | Sigma | S8045 | |
| 광학 필터 CFP 470/24nm (방출) | PerkinElmer | 2100-5850 | 바코드 240 |
| 광학 필터 Fura2 380/10nm (여기) | PerkinElmer | 2100-5390 | 바코드 112 |
| 광학 모듈: 베타 락타마제 | PerkinElmer | 2100-4270 | 바코드 418 |
| OriginPro 2017 소프트웨어 | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | 맞춤형 합성 |
| para-니트로블레비스타틴 | AMRI | N/A | 맞춤형 합성 |
| PEP(포스포(에놀)피루브산 모노칼륨염) | Sigma | P7127 | |
| PK(토끼 근육에서 추출한 피루브산 키나아제) | Sigma | P9136 | |
| 토끼 근육 아세톤 파우더 | 펠 프리즈 바이오로직스 | 41995-2 |
참고문헌
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Po....
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