이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
염색질 도메인의 조직 과 구조는 개별 세포 계에 고유합니다. 그들의 잘못된 조절은 세포 정체성 및 / 또는 질병에 있는 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 엄청난 노력에도 불구하고 염색질 도메인의 형성과 전파에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다. 크로마틴 도메인은 안정된 상태 조건 하에서 연구되어 왔으며, 이는 설립 기간 동안 초기 사건을 따르는 데 도움이되지 않습니다. 여기에서는 염색질 도메인을 유도적으로 재구성하고 시간의 함수로 재형성을 따르는 방법을 제시합니다. 비록, 먼저 PRC2 매개 억압 크로마틴 도메인 형성의 경우에 적용, 그것은 쉽게 다른 염색질 도메인에 적응 될 수 있었다. 유전체학 및 이미징 기술과 이 방법의 수정 및/또는 조합은 크로마틴 도메인의 설립을 매우 자세하게 연구하는 귀중한 도구를 제공할 것입니다. 우리는 이 방법이 염색질 도메인이 어떻게 형성되고 상호 작용하는지에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으킬 것이라고 믿습니다.
서론
진핵 게놈은 고도로 조직되고 염색질 접근성에 있는 변경은유전자 전사 1을 직접 통제합니다. 게놈은 전사 활동 및 복제 타이밍2,3와상관 관계가 있는 염색질 도메인의 명백한 모형을 포함합니다. 이러한 염색질 도메인은 몇 킬로베이스(kb)에서 100kb 이상까지 의 크기 범위이며 뚜렷한 히스톤변형 4의 농축을 특징으로 한다. 핵심 질문은 이러한 도메인이 어떻게 형성되고 어떻게 전파되는가하는 것입니다.
가장 잘 특징지어진 염색질 도메인 중 하나는 폴리콤 억압 복합체 2(PRC2)의 활성을 통해 육성된다. PRC2는단백질5,6의폴리콤 그룹(PcG)의 서브세트로 구성된 다중 소단위 복합체로, 히스톤 H3(H3K27me1/me2/me3)의 리신 27의 모노, 디-및트리메틸화를 촉매한다. 9
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프로토콜
유도성 EED 구조 MES 생성
1. 세포 배양
- 피더 프리 C57BL/6 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 사용하여 안정적으로 통합된 CreERT2 이식유전자를 보유하며, 이는 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)의 투여 시 핵으로 전이할 수 있다 13.
- 기존의 ESC 배지14,15에서mESCs를 성장시키고, 1000 U/mL LIF, 1 μM ERK 억제제 PD0325901 및 3 μM GSK3 억제제 CHIR99021로 보충하였다. 기존의 ESC 배지의 경우, 15% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 0.1 mM 2-메르카포에탄올을 함유한 녹아웃 DMEM을 사용하십시오.
- 미CS 배양에 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅된 플레이트를 사용하십시오.
2. 클론 EED 녹아웃 (KO) mES의 생성
- 설계 가이드 RNA(gRNAs)는 벤치클링 16의 CRISPR 설계 도구를 사용하여 MES에서 EED....
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결과
조건부 구조 시스템의 일반적인 계획
도 1은 내인성 EED 궤적으로부터 발현되는 WT 또는 케이지 돌연변이체(Y365A) EED를 사용하여 EED KO 세포를 조건부로 구출하는 표적화 방식을 나타낸다. 안정성과 효소 활성에 필수적인 PRC2의 핵심 하위 단위인 EED를 노크한 후, EED의 엑손 9에 이어인트론 내의 카세트가 도입된다(그림 1). 카세트는 내인성 유전자 서열에 대하여 역방향에서 EED의 나머지 3' cDNA 서열로 구성된다. 카세트는 이종역 loxP 사이트(lox66 및 lox71)18에의해 측면에 있다. 세포는 H3K27me2/3의 완전한 손실이 관찰될 때까지 전파됩니다. 4-OHT를 첨가하여 Cre 재조합 발현이 활성화되면, 카세트는 스플라이스 수락서 서열을 사용하여 카세트 내로 접합되도록
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토론
주어진 염색질 도메인의 형성 도중 기계론적인 세부사항을 이해하는 쪽으로 강력한 접근은, 먼저 도메인을 중단하고 세포 내의 진행 중인 그것의 재건을 추적하는 것입니다. 이 프로세스는 재구성 중에 언제든지 일시 중지되어 진행 중인 이벤트를 자세히 분석할 수 있습니다. 염색질 도메인에 대한 이전 연구는 정상 상태 조건(예: 야생형 및 유전자 녹아웃 비교)에서 수행되었기 때문에 이러한 이벤트를 해결할 수 없었습니다. 여기에서는, 우리는 세포에 있는 PRC2 중재한 억압도메인의 모집 그리고 퍼짐에 의해 강조된 것과 같이 염색질 도메인의 동적 형성을 평가하는 체계를 개략적으로 설명합니다.
이 유도 가능한 시스템에 대한 가장 중요한 단계는 세포에서 각각의 삭제 후 원하는 단백질 (또는 RNA)을 다시 발현하기 위해 DNA 구성물의 정확한 설계입니다. 다운스트림 응용 에 따라 다양한 돌연변이, 태그 및 형광 마커가 이러한 구문 내에서 도입될 수 있습니다. 예를 들어, GFP 직전에 자가 절개 .......
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공개 사항
D.R.은 별자리 제약 및 풀크럼 치료제의 공동 창립자입니다. 저자는 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
엘 발레스 박사, 디 오자타 박사, 에이치 무 박사님에게 원고 개정에 감사드립니다. D.R. 연구소는 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 보건원 (R01CA199652 및 R01NS100897)에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (Z)-4-하이드록시타목시펜(5 mg) | 시그마 | H7904-5MG | EED 발현 유도용 |
| 16% 파라포름알데히드 수용액(10x10 ml) | 전자 현미경 과학 | 15710 | 면역형광용 |
| 2-메르캅토에탄올 | LifeTechnologies | 21985-023 | mESC 배양용 |
| 2% 젤라틴 용액 | 시그마 | G1393-100ml | mESC용 culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | mESC용 |
| culture Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | 면역형광용 |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | 면역형광용 |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | 면역형 |
| DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드) - 10mg | Life Tech | D1306 | 면역형광 |
| ERK 억제제, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | mESC 배양용 |
| ESGRO 재조합 마우스 LIF 단백질 | Millipore/Fisher | ESG1107 | mESC 배양용 |
| FBS 줄기세포 인증 | 애틀랜타 | S10250 | mESC 배양의 |
| 경우 Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | 공여체 템플릿 클로닝 |
| GSK3 억제제, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | mESC 배양의 |
| 경우 H3K27me2 (D18C8) 토끼 mAB | 세포 신호 | 9728S | ChIP-seq |
| H3K27me3 | 세포 신호 | 9733S | ChIP-seq |
| 히스톤 H2Av에 대한 항체 항체 (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | mESCs 배양용 |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | mESCs 배양용 |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | Transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 면역형광용 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | mESC 배양용 |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | gRNA 클로닝용 |
| QuickExtract DNA 추출 솔루션 | Lucigen | QE0905T | 유전형 분석용 PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| 제로 블런트 PCR 클로닝 키트 | Thermo Fisher | K270020 | Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | 염기서열: ctctggctactgtcaactag. gRNA는 i-WT-r 및 i-MT-r 시스템용 C57BL/6 ESC에서 EED를 녹아웃합니다. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | 염기서열: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNA는 i-WT-r 및 i-MT-r 시스템용 C57BL/6 ESC에서 EED를 녹아웃하기 위해 쌍을 이룹니다. | ||
| EED-gRNA 유도 서 | 열: atggcaccccgaaattagaa. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-WT-r 시스템을 생성합니다. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-WT-r 시스템을 생성합니다. | ||
| EED-gRNA 유도 서 | 열: atggcaccccgaaattagaa. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-WT-r 시스템을 생성합니다. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-MT-r 시스템을 생성합니다. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | 서열: ctgtaggctgccatctgtga. 야생형 대립유전자는 1.9kb의 산물을 생성합니다. 녹아웃 대립유전자는 200bp의 산물을 생성합니다. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | 서열: agccagggctacacagagaa. 야생형 대립유전자는 1.9kb의 산물을 생성합니다. 녹아웃 대립유전자는 200bp의 산물을 생성합니다. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | 시퀀스: tgcagtgaaacaaatttggaa. 카세트가 삽입되면 프라이머는 1863bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 ~200bp의 산물을 생성합니다. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | 시퀀스: gagaggggtggcactgtaaa. 카세트가 삽입되면 프라이머는 1863bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 ~200bp의 산물을 생성합니다. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | 시퀀스: ccccctctttct. 카세트가 삽입되면 프라이머는 3200bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 1560bp의 생성물을 생성합니다. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | 서열: atgcctgggtgaatgaaaaaaaa. 카세트가 삽입되면 프라이머는 3200bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 1560bp의 생성물을 생성합니다. |
참고문헌
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (....
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재인쇄 및 허가
