여기서 우리는 견고한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 일관되게 생성하고 그 기능을 특성화하는 방법을 설명하고 검증한다. 이러한 기술은 신호 경로에 대한 기계적 통찰력을 개발하고, 대규모 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하고, 심장 질환을 안정적으로 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)는칼슘(Ca2+)취급 및 신호 전달 경로뿐만 아니라 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 분석의 기초 과학을 연구하기 위한 귀중한 인간 소스를 제공합니다. 본 명세서에서, 우리는 상이한 세포주 전반에 걸쳐 분자 및 기능적 특성을 일관되게 재현할 수 있는 고품질 iPSC-CM을 생성하는 데 사용되는 방법론에 대한 상세한 설명을 제공한다. 또한Ca2+ 처리 특성의 평가를 통해 기능적 특성화를 안정적으로 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 낮은 산소(O2)조건, 젖산 선택, 그리고 배양에서 장기간 시간은 고순도 및 고품질 심실 과 같은 심근 세포를 생성합니다. 고립 된 성인 쥐 심근 세포 (ARCMs)와 유사하게, 3 개월 된 iPSC-CMS는 더 높은 Ca2 + 진폭, Ca2 + 재섭취 (부패 - 타우)의 빠른 속도 및 30 iPSC-CS에 비해 β-아드레날린 자극에 대한 긍정적 인 감수성 반응을 나타낸다. 이 전략은 기술적으로 간단하고 비용 효율적이며 재현 가능합니다. 이 제품은 심장 질환을 모델링하고 Ca2+ 취급 단백질을 대상으로 하는 대규모 약물 스크리닝을 위한 견고한 플랫폼을 제공합니다.
서론
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)는 시험관내1, 2,3,4,5,6,7, 8에서다양한 심장 질환을 모델링하는 매력적인 인간 기반 플랫폼이다. 더욱이, iPSC-CM은 신규 또는 기존 약물에 대한 환자 반응의 예측, 히트 화합물을 스크리브하고, 새로운 맞춤형 약물을 개발하는 데 사용될 수있다 9,10. 그러나 상당한 진전이 있음에도 불구하고 iPSC-CM11을사용할 때 몇 가지 제한 사항과 과제를 고려해야 합니다. 따라서, 심장 분화 프로토콜을 개선하고, iPSC-CM의 효율및 성숙을 향상시키고, 특정 심근세포 아류형(심실, 심방 및 결절)을 생성하는 방....
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프로토콜
이 연구에서 성인 쥐 심근세포를 이용한 실험은 시나이 산의 아이칸 의과 대학의 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜로 진행되었습니다. 성인 쥐 심근세포는 앞서설명한 바와같이 랑엔도르프 계 법에 의해 스프라그 다울리 쥐 하트로부터 분리되었다.
1. 미디어 준비
- hiPSC 미디어를 준비합니다.
- 보충제와 기저 매질을 실온(RT)으로 평형화합니다. 보충 완전히 해동 되어 있는지 확인. 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 기저 배지의 400 mL및 100 mL의 보충제 및 필터를 혼합합니다. 사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 RT에 평형화하십시오.
- RPMI + B27을 준비합니다.
- B27 보충 및 기초 매체를 평형 (RPMI 1640) RT. 보충 완전히 해동 되어 있는지 확인. 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 기저 배지의 490 mL과 50x 보충제의 10 mL를 혼합하고 필터를 혼합합니다. 사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 RT에 평형화하십시오.
- RPMI + B27 (-) 인슐린을 준비하십시오.
- B27 (-) 인슐린 보충 및....
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결과
그림1A에 기술된 프로토콜은 배양 시간적 시간으로 심실/성인과 같은 표현형을 획득하는 고도로 순수한 심근세포를 생성했다. 심방 및 심실 미오신 조절 광계 2에 대한 면역형광 염색에 의해 평가된 바와 같이 2 개의 이소폼(MLC2A 및 MLC2V) 이 프로토콜에 의해 생성된 대부분의 세포는 심장 분화 유도 후 30일째에 MLC2A 양성이었으며, MLC2V는 동일한 시점에서 훨씬 낮은 양으로 발현되었다(그림2). 배양 시간이 증가함에 따라(60일 및 90일째), MLC2 이소폼(MLC2A to MLC2V)의 완전한 전환이 관찰되었다(도2A,하단 패널). MLC2A 및 MLC2V 양성 세포를 정량화하기 위해 유세포 분석이 수행되었습니다. 면역형광 결과에 따라, 유세포분석 데이터는 MLC.......
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토론
인간 iPSC-C를 실험 모델로 사용하기 위한 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 일관된 성능과 재현 가능한 결과를 보장할 수 있는 고품질 심근세포(CM)를 생성합니다. 2) 세포가 적어도 90 일 동안 배양에서 성숙하여 표현형을 적절하게 평가할 수 있도록 하는 단계; 3) 전기 생리학 연구를 수행, 예를 들어 칼슘(Ca2+) 과도 측정, 인간의 iPSC-CM의 생리학적 으로 관련된 기능적 특성을 제공하기 위해. 우리는 고품질의 심실 과 같은 iPSC-CS를 생성하는 단층 기반 의 분화 방법을 개발했습니다. 우리의 방법은 몇 가지 중요한 요인에 의존하고 기존 프로토콜14,18의변형이다 . 다른 프로토콜과 는 달리, 이것은 iPSCs 유지보수뿐만 아니라 MS로의 분화의 첫 주 동안 낮은 산소 조건 (5%O2)을사용합니다. 저산소 조건은 또한 i.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 AHA 과학자 개발 보조금 17SDG33700093 (F.S.)에 의해 지원되었다; 마운트 시나이 KL2 임상 및 중개 연구 경력 개발 KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 및 AHA 18TPA34170460 (C.K.).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 안티 액틴, α - 평활근 항체, 마우스 단클론 | 시그마 Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 염소 안티 토끼 | Invitrogen | A21428 | |
| B27 보충제 | Gibco | 17504-044 | |
| B27 (-) 인슐린 보충제 | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI 핵 염색 | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-글루타민 + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| 양단 세포 리프터, 플랫 블레이드 및 J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon 멀티웰 조직 배양 플레이트, 6웰 | 코닝 | 353046 | |
| 유체 인라인 히터 | 라이브 셀 기기 | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC 인증 매트릭스 | Corning | 354277 | Matrigel 매트릭스 |
| hPSC 배지 | Gibco | A33493-01 | StemFlex 기초 배지 |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| 라이브 셀 이미징 챔버 | 라이브 셀 기기 | EC-B25 | |
| MLC-2A, 단클론 마우스 항체 | 시냅스 시스템 | 311011 | |
| Myocyte 칼슘 및 수축 시스템 | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 항체, 토끼 다클론(MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| PES 멤브레인이 있는 Nalgene Rapid Flow 멸균 일회용 필터 장치 | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS, 칼슘 및 마그네슘 포함 | Corning | 21-030-CV | |
| PBS, 칼슘 및 마그네슘 제외 | Corning | 21-031-CV | |
| 프리미엄 유리 커버 슬립, | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI 매체, 1640 (-) D-포도당 (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI 매체 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| 나트륨 L-젖산염 | 시그마 Aldrich | L7022 | |
| StemFlex 보충제 | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode의 솔루션 | Boston Bioproducts | BSS-355w | pH 7.2로 조정. 1.2mM 염화칼슘 추가 |
참고문헌
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
- Moretti, A., et al.
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