Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.
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방법 논문
박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
J 도메인 단백질 (JDPs)은 진핵 세포에서 가장 크고 가장 다양한 코 샤페론 패밀리를 형성합니다. 최근 연구 결과에 따르면 JDP 패밀리의 특정 구성원은 진핵생물에서 일시적인 이종 복합체를 형성하여 70kDa 열 충격 단백질(Hsp70) 샤페론 계 단백질 다이그레그가스에 대한 기질 선택을 미세 조정할 수 있음을 보여줍니다. JDP 복합체는 급성/만성 스트레스 유발 응집 단백질을 표적으로 하고 아마도 단백질 응집체의 표면에 다중 Hsp70s를 모집하여 분리증을 조립하는 것을 돕습니다. 이러한 물리적으로 상호 작용하는 JDP에 의해 형성된 단백질 품질 관리(PQC) 네트워크의 범위는 생체 내에서 크게 특성화되지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 뚜렷한 세포 구획에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 복합체를 강력하게 포획할 수 있는 근접 결찰 분석법(PLA)이라는 이름의 현장 단백질 상호작용 분석법에 근거한 현미경 검사법을 기술한다. 우리의 일은 인간 세포에서 효모(Saccharomyces cerevisiae)와박테리아(대장균)로PLA의 고용을 확장하여 일시적으로 형성 된 단백질 어셈블리의 역학을 모니터링하는 중요한 도구가되었습니다. 시핵 세포와 진핵 세포.
서론
세포 상호 작용에 대한 우리의 불완전한 이해로 인해 광대한 양의 유전체 정보는 해석할 수 없습니다. 화학적 가교 및 단백질 공동 국소화가 없는 단백질 공동 면역 침전과 같은 기존의 단백질-단백질 상호 작용 검출 방법론은 널리 사용되지만 다양한 단점을 제기합니다. 주요 단점 중 일부는 상호 작용의 가난한 정량화 및 비 네이티브 바인딩 이벤트의 잠재적인 도입을 포함 합니다. 비교에서, 새로운 근접 기반 기술은 세포에서 단백질 상호 작용을 포착하기위한 대안과 강력한 접근 방식을 제공합니다. 근접 결찰 분석(PLA)1은 현재 독점 키트로 사용할 수 있으며, 상호 작용하는 하위 단위의 근접에 기초하여 단백질 복합체를 구체적으로 표적화하는 항체를 사용합니다.
PLA는 표적 단백질 복합체의 표면에 작은 DNA 태그(PLA 프로브)를 가진 1차 및 이차 항체로 구성된스캐폴드의 형성에 의해 개시된다(도 1, 단계 1-3). 다음으로, DNA 태그의 근접에 의해 결정되며, 원형 DNA 분자는 커넥터 올리고뉴클레오티드를 가진 혼성화를 통해 생성된다(도1,단계 4). 원형 DNA의 형성은 DNA 결찰 단계에 의해 완....
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프로토콜
1. 헬라 세포 준비
- 다음 자료를 준비: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4),pH 7.4; DMEM, 10% FCS와 1% 펜-스트렙으로 보충; PBS에서 4% 파라포름알데히드; PBS에서 0.5 % 트리톤 - X100; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM 트리스, 0.05% 트웬), pH 7.4; 0.0001 % 멸균 폴리 - L-리신 용액; 10 웰 진단 슬라이드; 습한 챔버; 티슈 페이퍼; 그리고 코플린 슬라이드 염색 항아리.
참고: 최적의 고정 효율을 보장하기 위해 파라포름알데히드 용액은 모든 실험 전에 신선하게 준비되어야 합니다. - 젖은 조직으로 닫힌 상자의 바닥을 덮어 습한 챔버를 준비하십시오. 실험을 시작하기 전에 습한 챔버를 37°C에 놓고, 효소 반응을 배양하면서 챔버 온도가 37°C에 있는지 확인합니다.
- T25 플라스크에서의 배양 헬라 세포는 5% CO2를 함유하는 37°C CO2 인큐베이터에서 10% FCS 및 1% 펜-스트렙으로 보충된 DMEM의5 mL(고당포도, 글루타메이트 및 나트륨 피루베이트 보충제)에서....
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결과
정제된 단백질을 이용한 당사의 이전 시험관 내 연구는 인간 클래스 A 및 클래스 B JDP의 하위 집합이 광범위한 응집된 단백질을 효율적으로 표적으로 하고 Hsp70 기반의 조립을 용이하게 하기 위해 일시적인 혼합 클래스 JDP 복합체를 형성한다는 것을 밝혀냈습니다. 단백질분리7. 우리는 혼성 클래스 (A +B) JDP 복합체가 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa)에서 발생하는지 여부를 결정하기 위해 PLA를 사용했습니다. 인간 JDPs DNAJA2(클래스 A) 및 DNAJB1(클래스 B)은 고도로 특이적인1차 항체 및 이차 PLA 프로브(도 2A-C)로 표적화되었다. 적색 형광 천공의 출현은 헬라 세포에서 혼합 클래스 DNAJA2 및 DNAJB1 복합체의 존재를 나타내었으며(도2C)이전의 생화학적 발견을 확인하였습니다7.......
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토론
공동 면역 침전 및 공동 국소화 기반 접근법은 단백질 조립을 특성화하는 오랜 방법으로 사용되어 왔다. 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체의 검출은 이러한 전통적인 방법의 주요 과제이며, 그 결과, 이전의 발견은 주로 질적 해석으로 제한된다. 세포 용해 기지를 둔 공동 면역 침전 기술은 수시로 단백질 단백질 상호 작용을 안정시키기 위하여 가교를 요구합니다. 세포 용해는 일시적으로 형성된 샤페론 복합체를 방해할 위험을 증가시키는 반면, 가교는 비네이티브 상호작용을 유발할 수 있으며, 특히 대부분의 샤페론의 고유 "끈적거림"에 의해 유발됩니다. 공동 면역 침전을 사용하여 Hsp70 샤페론 시스템을 분석할 때, 잠재적인 아티팩트는 (a) 샤페론의 높은 발현 수준 및 (b) 멤브레인 또는 단백질 골재 결합 샤페론 기계와 관련된 용해도 문제에서 발생할 수 있습니다. 게다가, 공동 면역 침전 기지를 둔 기술은 관련되는 기능을 delineating를 위해 중요할 수 있던 붙잡힌 단백질 어셈블리의 세포 국소화에 아무 정보도 제공하지 않습니다. .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
NBN은 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 자금으로 모나시 대학 의학 간호 및 건강 과학 학부의 특별 모집 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 베른트 부카우 (ZMBH, 하이델베르크 대학, 독일) 및 Harm H. Kampinga (세포 및 시스템 학과, 그로닝겐 대학, 네덜란드) 시약의 귀중한 지원과 공유에 감사드립니다, 홀거 로렌츠 (ZMBH) 이미징 시설, 하이델베르크 대학, 독일) 공초점 현미경 및 이미지 처리와 그의 지원에 대한, 클레어 허스트 (ARMI, 모나시 대학, 호주) 원고의 비판적 독서.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 37% 포름알데히드 | Merck | 103999 | |
| Acetone Sigma-Aldrich | 32201 | ||
| anti-DNAJA2 항체 | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 항체 | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK 항체 | In house | ||
| anti-mCherry 항체 | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 항체 | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 항체 | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP 항체 | 사내 | ||
| Coplin 슬라이드 염색 용기 | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| 진단 슬라이드 | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink 현장 검출 시약 주황색 | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA 프로브 안티 마우스 MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA 프로브 안티 래빗 PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, 형광 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| 태아 송아지 혈청 | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| 라이소자임 | 시그마-알드리치 | 62971 | |
| 메탄올 | 시그마-알드리치 | 32213 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마-알드리치 | P6148 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 테르모피셔 | 15070063 | |
| 폴리-L-라이신 | 시그마-알드리치 | P47-07 | |
| 소르비톨 | 시그마-알드리치 | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | 미국 Biological | Z1004 |
참고문헌
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addit....
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재인쇄 및 허가
