임상 조직 견본의 나노 규모 화상 진찰은 질병 병인의 이해를 향상할 수 있습니다. 확장 병리학 (ExPath)은 표준 임상 조직 샘플과의 호환성을 위해 변형 된 확장 현미경 검사법 (ExM)의 버전으로, 기존의 회절 제한된 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 스케일 구성을 탐구합니다.
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이 논문에서
요약
초록
현대 병리학에서 광학 현미경 검사는 임상 표본의 현미경 구조를 밝혀 질병 진단에 중요한 역할을합니다. 그러나, 근본적인 물리적 회절 한계는 기존의 광학 화상 진찰 접근을 사용할 때 나노 규모 해부학 및 미묘한 병리학 적인 변경의 심문을 방지합니다. 여기에서, 우리는 임상 1 차 조직 견본의 일반적인 모형의 나노 규모 광학 화상 진찰을 위한 확장 병리에게 불린 간단하고 저렴한 프로토콜을 기술합니다, 둘 다 고정 된 동결 또는 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직을 포함하 섹션. 이 방법은 조직 샘플을 화학적으로 조직 하이드로겔 하이브리드로 변환하고 순수한 물의 여러 비늘에서 등열대로 물리적으로 확장하여 광학 회절 한계를 우회합니다. 확장으로 인해 이전에는 해결할 수 없는 분자가 분리되어 기존의 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.
서론
3차원(3D) 맥락에서 조직의 분자 조직을 조사하면 생물학적 기능과 질병 발달에 대한 새로운 이해를 제공할 수 있습니다. 그러나, 이러한 나노 스케일 환경은 최소 한용화 거리, dα/λ NA에 의해 정의되는 종래의 회절 제한 현미경(200−300 nm)의 분해 능을 넘어서는 것이다. 여기서 λ는 빛의 파장이고 NA는 이미징 시스템의 수치 개구부(NA)이다. 최근에는 형광 표지된 분자의 직접 시각화가 새롭게 개발된 초고해상도 이미징 기술1,2,3,자극방출 고갈(STED)을 포함하여 가능해졌으며, 사진 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM), 연속 광학 재건 현미경 검사법 (STORM), 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM). 이러한 이미징 기술은 나노 스케일에서 생물학적 기능에 대한 이해에 혁명을 일으켰지만 실제로는 고가의 및 ....
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프로토콜
1. 주식 시약 및 솔루션 준비
-
겔화 용액 성분을 준비합니다.
참고: 용액 농도는 g/mL(w/v%)으로 제공됩니다.- 다음 재고 솔루션을 확인: 38% (w/v) 나트륨 아크릴산염 (SA), 50% (w/v) 아크릴아미드 (AA), 2% (w/v) N,N′,N′-메틸렌네비사크릴라미드 (비스), 그리고 29.2% (w/v) 염화나트륨 (NaCl). 이중 탈이온수(ddH 2O)에화합물을 용해시켰다. 표 1의 양을 참조로 사용합니다. 준비된 솔루션은 필요에 따라 볼륨을 확장 하거나 축소할 수 있습니다. 예를 들어 38%(v) SA 용액의 10mL를 만들려면 1.9gSA를 그라디드 10mL 실린더에 추가하고 5mL의 부피에 ddH2O를추가합니다.
- 표 1에나타낸 바와 같이 1.06x 농도로 9.4 mL의 단량액을 준비한다.
참고: 이는 이니시에이터, 가속기 및 억제제의 첨가 후 1배 농도를 초래할 것이다. 단량체 스톡은 최대 3개월 동안 4°C또는 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. - 다음 주식 용액을 ddH2O에서 별도로 준비: 억제....
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결과
프로토콜이 성공적으로 수행된경우(그림 1),샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 겔로 나타나며(그림3A)물 속에서 3−4.5배의 비율로 확장할 수 있음(그림3B) ~70nm의 유효 분해능을 제공하는 최종 팽창계수 및 이미징 시스템은5,16을사용한다. 도 4는 ExPath 프로토콜을 사용하여 처리된 5 μm 두께의 FFPE 신장 샘플의 예시를 나타낸다. 겔화 된 샘플의 전체 팽창은 물에서 4.5 배 확장 인자를 초래하여 0.95 NA 목표를 사용하여 이미지 화 할 때 ~ 63 nm의 효과적인 분해능을 제공합니다. 조직은 먼저 파라핀을 제거하고 재수화(섹.......
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토론
여기에서는 FFPE, H&E 스테인드 및 유리 슬라이드에 새로 얼어붙은 시편을 포함하여 병리학에 사용되는 가장 일반적인 유형의 임상 생검 샘플에 적용할 수 있는 proExM5의 변형인 ExPath 프로토콜16을제시합니다. 견본의 포맷 변환, 항원 회수 및 면역 염색은 ExPath에 특이적이지 않은 일반적으로 사용되는 프로토콜을 따릅니다. 원래 proExM 프로토콜9와는 달리, ExPath는 원래 ExPath 연구16에서입증 된 바와 같이, 포르말린 고정 조직의 확장을 향상 소화 버퍼에 EDTA의 높은 농도에 의존한다. 이 프로토콜은 5-10 μm 두께의 임상 시편16에서검증되었지만, 일부 변형을 통해 두꺼운 조직 샘플에도 적용될 수 있었다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 겔화 단계의 타이밍.......
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공개 사항
YZ 및 OB는 여기에 기재된 기술의 하위 집합에 대해 특허 보호를 출원하고 획득한 발명자 중 2명입니다(미국 특허 US20190064037A1, WO2018157074A1 및 WO201815704A1 및 WO201815704A1).
감사의 글
이 작품은 카네기 멜론 대학에서 학부 창업 기금에 의해 지원되었다 (YZ) 및 NIH 이사의 새로운 혁신 상 (DP2 OD025926-01 YZ에).
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재료
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| 아세톤 | 피셔 Scientifc | A18-500 | |
| 아크릴아미드 | 시그마 Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| 아가로스 | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| 과황산암모늄 (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 항체 토끼에서 생산 | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV 항체 마우스 | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin 항체 닭고기에서 생산 | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II 소수성 펜 | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | 핵 염색 |
| 다이아몬드 나이프 No. 88 CM | 일반 도구 | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 산(EDTA) 0.5M | VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE 신장 샘플 | USBiomax | HuFPT072 | |
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| Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
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| 소듐 클로라이드 | Sigma Aldrich | S6191 | |
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| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | 로 표지된 밀 배아 응집소 |
참고문헌
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann,....
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