이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

1 차 간세포 보존을 위한 대량 물방울 유리화

5.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60250

⸱

2019년 10월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

이 논문에서

요약

이 원고는 1 차 세포가 낮은 농도에서 저온 보호 제로 미리 배양되고 큰 물방울에서 유리화되는 다량의 쥐 간세포를 위한 얼음없는 동결 보존 방법을 기술합니다.

초록

Vitrification은 생물학적 시료의 고전 저감 동결(약 1°C/min)의 냉동 보존을 위한 유망한 얼음 없는 대안입니다. 유리화는 해로운 얼음 형성을 피하면서 유리 상으로 물의 전환을 달성하기 위해 매우 빠른 냉각 속도를 필요로한다. 냉동 보호제(CPA)를 사용한 사전 인큐베이션은 생물학적 시료의 중요한 냉각 속도를 감소시킬 수 있지만, 유리화에 의한 얼음 없는 냉동 보존을 위해서는 일반적으로 고농도가 필요합니다. 그 결과, 유리화는 CPA 독성에 의해 방해되고 빠르게 냉각될 수 있는 작은 샘플로 제한됩니다. 최근에는 이러한 고유의 한계가 대량 액적 유리화에 의해 극복될 수 있음을 입증되었다. 이 새로운 방법을 사용하여, 세포는 먼저 낮은 세포 내 CPA 농도로 미리 배양된다. 급속한 삼투성 탈수를 활용하는 세포내 CPA는 독성 CPA 농도를 완전히 평형화할 필요 없이 유리화 바로 전에 농축됩니다. 세포 탈수는 유체 장치에서 수행되며 액체 질소에서 유리화되는 대형 액적의 연속높은 처리량 생성과 통합됩니다. 최소한의 CPA 독성을 가진 이 얼음 없는 동결 보존 방법은 대량의 세포 양에 적합하며, 기존의 느린 동결 동결 보존에 비해 간세포 생존력과 대사 기능이 증가합니다. 이 원고는 성공적인 대량 물방울 유리화에 대한 방법을 자세히 설명합니다.

서론

간세포의 동결 보존 후 세포 생존력 및 대사 기능의 상실은 여전히 임상적용을제한하는 주요 문제이며1,2,3. 간세포 동결 보존의 벤치 마크 방법은 CPA (디메틸 설폭사이드 [DMSO], 포도당 및 알부민)로 간세포를 미리 배양하고 후속 제어 속도 동결 (약 1 °C / 분)에 수행되는 느린 동결입니다. 극저온4,5. 많은 보고된 최적화에도 불구하고, 얼음 형성의 동결 및 기계적 응력 동안 해로운 삼투성 불균형과 함께 CPA 독성은 느린 동결6,7의근본적인 단점으로 남아 있다.

Vitrification은 얼음 형성으로 인한 부상이 유리 상태로물의 직접 상 전환에 의해 완전히 회피되는 것을 통해 서두르는 이점을 제공한다6. 그러나 순수한 물(-137°C)의 유리 전이 온도에 도달하려면 유리 전이 온도 8 을 초과하는 얼음 형성을 피하기 위해 물은 초당 섭씨 100만 도(즉, 임계 냉각 속도)의 속도로 냉각되어야합니다. . CPA를 추가하면 임계 냉각 속도를 낮추고 수성 솔루션의 유리 전이 온도를 높일 수있습니다 9. 그러나 CPA 농도가 높은 경우에도(예: 40% v/v DMSO 이상) 빠른 냉각 속도는 그럼에도 불구하고 성공적인 유리화8,9에필요합니다.

필요한 냉각 속도와 높은 CPA 농도는 유리화의 두 가지 주요 단점을 초래합니다. 첫째, 빠른 냉각을 가능하게 하려면 시료의 열 질량이 낮아야 합니다. 둘째, 삼투성 손상을 피하면서 높은 CPA 농도에 도달하려면 CPA가 천천히 도입되어야하며 세포 내 구획과 세포 외 구획 사이에 완전히 균형을 이루어야합니다6. 이것은 유독한 CPA에 세포의 노출 시간을 증가시킵니다. 함께, 이것은 유리화한 번에 몇몇 작은 크기의 견본 (마이크로 리터)로 제한되는 성가신 프로세스를 만듭니다. 물방울 유리화는 이러한 제한에 대한 잠재적인 해결책으로서 제안되었다. 액체 질소에 최소 세포-라덴 방울(nanoliters)을 노출시킴으로써 냉각 속도가 현저히 증가하여 CPA농도10,11,12의 상당한 감소를 허용합니다. ,13,14. 다중 고주파 액적 발생 노즐을 동시에 사용할 수 있지만, 매우 작은 액적 크기는 분당마이크로리터10으로처리량을 제한하여 대형 셀의 효율적인 유리화를 배제합니다. 분당 밀리리터 의 순서에 더 높은 처리 속도볼륨.

최근에는 이러한 고유의 유리화한계를 벌크 액적유리화(15)에의해 극복할 수 있음을 입증했다. 이 새로운 방법은 신속한 삼투성 탈수를 활용하여 유리화 직전에 7.5% v/v 에틸렌 글리콜 및 DMSO의 세포내 CPA 농도를 집중하여 독성 CPA 농도의 완전한 평형화의 필요성을 제거합니다. 세포 탈수는 높은 세포외 CPA 농도에 간세포의 짧은 노출에 의해 유체 장치에서 수행된다. 이 노출은 급속한 삼투성 탈수를 일으키는 원인이 더라도, 세포로 확산하기 위하여 높은 CPA 사격량이 너무 짧습니다. 탈수 직후, 세포는 액체 질소에서 직접 유리화되는 액적에 로드됩니다. 이 방법은 높은 세포외 CPA 농도가 큰 액적의 유리화를 가능하게하여 CPA 독성을 최소화하면서 높은 처리량 볼륨을 생성하면서 높은 CPA 농도의 전체 세포 내 섭취의 필요성을 제거합니다.

물방울 유리화는 보존 후 직접 및 장기 생존력을 향상시키고, 1차 쥐 간세포의 형태및 대사 기능을 느리게 동결시킴으로써 고전적 냉동 보존에 비해향상된다. 이 원고는 1차 쥐 간세포의 대량 액적 유리화에 대한 방법론적 세부사항을 제공한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 프로토콜에 대한 기본 간세포 격리는 미국 매사추세츠 주 보스턴의 종합 병원에서 세포 자원 코어(CRC)에 의해 수행되었습니다. 동물 프로토콜 (#2011N000111)은 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 대량 물방울 유리화

  1. 유리화 솔루션을 준비합니다.
    1. 40 mg의 소 혈청 알부민(BSA)을 위스콘신 대학교 용액(UW)의 17.0 mL에 첨가하여 유리화 용액 1(V1)을 만듭니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 V1 용액을 멸균 필터하고 4°C에서 보관합니다.
      참고 : UW는 일반적으로 사용되는 장기 보존 솔루션입니다. 50g/L 하이드록세틸전분, 35.83 g/L 락토바이오닉산, 3.4 g/L 칼륨 인산모노베이직, 1.23 g/L 황산 마그네슘, 17.83 g/L 라피노스 펜타하이드레이트, 1.34 g/L 아데노신, 0.136 g/L 알로푸리놀, 0.992 g/L 총 글루타티온 6.1 /L 수산화칼륨, 및 수산화나트륨은 pH를 7.4로 조절한다.
    2. 7.0 mL의 UW, 6.5 mL의 DMSO, 6.5 mL의 에틸렌 글리콜 (EG), 40 mg의 BSA 및 5.48 g의 자당을 결합하여 유리화 용액 2 (V2)를 만듭니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 V2 용액을 멸균 필터. 3mL 주사기에 멸균 여과된 V2 용액 3.5 mL를 적재하고 4°C에서 보관하십시오.
      참고: CPA의 용해를 용이하게 하기 위해 솔루션은 필요한 것보다 더 많은 양으로 준비됩니다.
  2. 벌크 액적 유리화 장치를 준비한다.
    1. 혼합 바늘을 준비하려면 먼저 혼합 바늘의 외부 회색 슬리브의 한쪽을 따라 자른 다음 슬리브를 열어 혼합 바늘에서 제거합니다.
    2. 혼합 바늘의 입구 위에 2개의 25mm 실리콘 튜브 섹션을 밀어 붙이고 접착제로 위치를 고정합니다(그림1A).
    3. 도 1A에도시된 바와 같이 바늘을 20 mm 길이(즉, 내부 혼합 나선의 길이)로 자른다.
      참고 : 혼합 바늘 길이는 바늘 내부의 부피에 비례하므로 높은 CPA 농도 용액에 대한 간세포의 노출 시간을 제어하도록 변경할 수 있습니다.
    4. 혼합 바늘의 컷오프 출구를 20G 주사 바늘에 삽입합니다(그림1B).
      참고 : 주사 바늘 크기는 액적 크기에 영향을 미칩니다.
    5. 오토클레이브에 의해 혼합 바늘 어셈블리를 살균.
    6. 멸균 된 드와르를 액체 질소로 채웁니다. 이소프로판올로 드와르의 외부를 살균한 후 멸균 된 층류 세포 배양 후드에 Dewar를 배치하십시오.
      참고: 액체 질소에 액적을 직접 노출하는 동안 오염은 중요한 고려 사항입니다. 현재 프로토콜에서 비멸균 액체 질소를 사용한 오염은 없었지만, 액체 질소는 필요한 경우 멸균을 보장하기 위해 여과 또는 조사될 수 있다16.
    7. 액상 질소 Dewar의 내직경과 동일한 외부 직경을 가진 깔때기를 50 mL 원추형 튜브에 삽입하여 액적 수집 장치를 생성한다(도1C-E).
    8. 큰 집게를 사용하여 최종 수직 위치에서 천천히 눌러 액적 수집 장치를 액체 질소에 담급합니다. 원유 관이 Dewar의 하단에 수직 위치에 달려 있는지 확인하십시오(그림 1D-E).
      참고: 깔때기는 원유관에 삽입되고 쉬어야 합니다. 그림 1D와같이 액체 질소 수준은 깔때기의 입구 높이보다 1cm 낮아야 합니다.
    9. 주사기 펌프의 발에서 세포 배양 후드 벽에서 돌출된 나사에 끈을 묶어 세포 배양 후드의 벽에 수직 위치에 주사기 펌프를 장착합니다.
    10. 액체 질소 Dewar를 수직으로 장착된 주사기 펌프 아래에 액적 수집 장치와 함께 놓습니다(그림1E).
  3. CPA로 사전 인큐베이션.
    1. 갓 분리된 쥐 간세포를 얻은 후, Trypan blue 배제에 의한 재고 농도를 계산하고 4천만 개의 생존 가능한 간세포를 취합니다.
      참고: 현탁액에서 간세포를 부드럽게 취급하는 것은 세포 사멸을 방지하는 데 중요합니다.
    2. 브레이크없이 5 분 동안 50 x g의 원심 분리기.
    3. 상월체를 흡인하고 V1 용액의 3.4 mL에서 간세포를 재중단한다.
    4. 얼음에 3분 동안 배양합니다.
    5. 간세포에 DMSO 150 μL과 EG 150 μL을 넣고 부드럽게 섞습니다.
    6. 얼음에 3분 동안 배양합니다.
    7. 다시, 간세포에 DMSO 150 μL과 EG 150 μL을 넣고 부드럽게 섞습니다.
    8. 3mL 주사기에 3.5mL를 적재하십시오.
  4. 유리화를 수행합니다.
    1. 미리 배양된 간세포와 V2 용액 주사기를 주사기 펌프 어댑터에 삽입합니다.
    2. 주사기에 두 개의 여성 루어 잠금 호스 바브 어댑터를 부착하고 바브 피팅 위에 혼합 바늘 어셈블리의 실리콘 튜브를 밀어 넣습니다(그림 1F).
    3. 전체 어셈블리를 주사기 펌프에 놓습니다(그림1E).
    4. 간세포에 DMSO와 EG를 마지막으로 추가한 후 3분 후, 2 mL/min에서 펌프를 시작합니다.
    5. 액체 질소에 모든 간세포가 첨가된 후 펌프를 중지하십시오.

2. 극저온 저장

  1. 도 1B와같이 20 G 바늘을 사용하여 50 mL 원추형 튜브의 뚜껑에 10 개의 작은 구멍을 뚫고 뚜껑의 외부를 유연한 필름으로 감쌉니다. 이것은 남은 액체 질소를 증발시키는 탈출을 가능하게하는 밸브를 만듭니다.
  2. 유리화된 간세포 방울을 수집하려면 먼저 액체 질소 Dewar에서 깔때기를 제거합니다. 다음으로, 긴 집게를 사용하여 액체 질소에서 방울을 포함하는 원추형 튜브를 꺼내서 원추형 튜브에서 과잉 액체 질소를 천천히 부어 냅니다.
  3. 구멍이 뚫린 뚜껑으로 원추형 튜브를 닫고 액체 질소 Dewar에 유리화 된 간세포 방울로 닫힌 원추형 튜브를 직접 놓습니다.
  4. 액체 질소에서 원엽 튜브를 액체 질소 증기 저온 탱크로 옮김.

3. 유리화된 간세포 방울의 재온난화

  1. 재온난화 솔루션을 준비합니다.
    1. DMEM 간세포 배양 배지 100 mL에 자당 17.13 g을 용해하여 재온난화 용액을 만듭니다. 멸균 필터는 0.22 μm 필터를 사용하여 재온난화 용액을 37°C로 따뜻하게 걸다.
  2. 간세포에 다시 따뜻하게.
    1. 저온 탱크에서 유리화 된 간세포로 원두 튜브를 가져 와서 액체 질소 Dewar로 운반하여 세포 배양 후드로 운반하십시오.
    2. 뚜껑을 가볍게 풀고 원추형 튜브를 액체 질소에 다시 넣습니다.
    3. 유리화된 간구 방울을 빈 비커에 넣고, 즉시 따뜻한(37°C) 재온난화 용액을 추가하고, 즉시 10s동안 저어줍니다.
      참고: 재작업 중에 동결을 피하기 위해 신속하게 작업하는 것이중요합니다. 연구 요구 사항에 따라, 모든 유리방울에 몇 한 번에 다시 따뜻하게 할 수 있습니다.
  3. 재웜 솔루션을 언로드합니다.
    1. 두 개의 50 mL 원엽 튜브에 간세포로 재온난화 용액을 나눕니다.
    2. 브레이크없이 4 °C에서 100 x g에서 2 분 동안 두 개의 원원튜브를 원심 분리합니다.
    3. 상급체는 원추형 튜브의 졸업 마크를 사용하여 총 부피를 12.5 mL남기고 원추형 튜브당 12.5 mL의 얼음 차가운 DMEM을 추가하여 재온난화 용액을 50%로 희석시다.
    4. 간세포를 다시 일시 중단하고 3 분 동안 얼음에 배양하십시오.
    5. 원추형 튜브당 25 mL의 얼음 차가운 DMEM을 추가하여 재온난화 용액을 25%로 희석시다.
    6. 브레이크없이 4 °C에서 50 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
    7. 상월체를 흡인하고 사용하기 위해 원하는 배양 배지의 2 mL에서 간세포를 재중단한다.
      참고: 밀도 구배 원심분리는 원하는 경우 세포 현탁액에서 죽은 간세포를 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

5개의 상이한 쥐 간으로부터 갓 단리된 1차 간세포는문헌4에보고된 저명한 저속 동결 프로토콜을 이용하여 고전적인 동결보존에 대한 대량 액적 유리화의 직접적인 비교를 위해 사용되었다4, 5. 요컨대, 간세포는 BSA (2.2 mg / mL), 포도당 (333 mM), 및 DMSO (10 % v / v)로 보충된 UW에서 부유하고 제어 된 속도 냉동고를 사용하여 냉동하였다. -196°C에서 저장한 후, 샘플을 따뜻한 수조에서 해동하였다. 모든 얼음이 녹은 후, DMSO는 직접 희석되었고, 포도당 농도는 삼투성 손상을 감소시키기 위해 여러 단계 동안 점차적으로 낮아졌다. 정확한 프로토콜은 다른 곳에서 자세히 찾을 수 있습니다15. 보존 기간은 2 일에서 8 일까지 다양하고 동등한 비교를 보장하기 위해 각 생물학적 복제에 대한 대량 액적 유리화 및 동결 냉동 보존 사이에서 일치시켰습니다....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

간세포의 동결은 생존력과 신진 대사 기능을 감소시이어냅니다. Vitrification는 동결 부상이 완전히 피할 수 있기 때문에 고전적인 냉동 보존을위한 유망한 대안을 제공합니다9. 그러나, CPA를 가진 사전 인큐베이션은 임계 냉각 속도8을낮추기 위하여 요구됩니다. 따라서, 유리화는 CPA 독성17에 의해 방해되고 작은 샘플 부피에 제한된다. 이러한 한계를 극복하기 위한 노력의 일환으로 본 원고에 제시된 벌크 액적 유리화 방법은 낮은 사전 배양된 CPA농도(15)를사용하면서 다량의 세포의 유리화를 가능하게 하기 위해 개발되었다. 이러한 대량 액적 유리화는 문헌에서 가장 최적의 저속 동결 동결 보존 방법에 비해 간세포 생존율 및 대사 기능 증가로 이어집니다. 여기서, 절차의 실질적인 측면에 있는 대량 물방울 유리화및 상세한 통찰력의 포괄적인 방법이 제공된다.<...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언합니다. Dr. de Vries, Weng, 토너, 테시에, Uygun 박사는 이 연구와 관련된 가처분 특허 출원을 가지고 있습니다. Uygun 박사는 장기 보존 기술 개발에 중점을 둔 기관인 Organ Solutions에 재정적 관심을 가지고 있습니다. 모든 연구자의 이익은 이해 상충 정책에 따라 MGH 및 파트너 건강 관리에 의해 관리됩니다.

감사의 글

미국 국립 보건원(R01DK096075, R01DK107875 및 R01DK114506)과 미국 국방부(DoD RTRP W81XWH-17-1-0680)의 자금 지원이 크게 인정받고 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BD 일회용 3mL 주사기, Luer-Lok 팁포함, Fisher Scientific14-823-435
비커Sigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW 냉장 보관 솔루션Bridge to LifeBUW-001
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA7906
Cole-Parmer 암컷 Luer-1/16" 로우 프로파일 반강성 튜브 미늘, PPCole-ParmerEW-45508-12
극저온 스트로지 탱크 / Cryotank차트 산업MVE 800
디메틸 설폭 사이드시그마 - 알드리치D8418
DMEM, 분말, 고 포도당, 피루브 산Technologies12800-082
에틸렌 글리콜시그마 - 알드리치107-21-1
매우 긴 집게Fisher Scientific10-316C
Fisherbrand 고속 이지 리더 플라스틱 원심분리기 튜브 - 플랫 탑 클로저Fisher Scientific06-443-18
낚싯줄StrenSOFS4-15
액체 질소Airgas7727-37-9
Masterflex L/S 백금 경화 실리콘 튜빙, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
믹스 팁, 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene 폴리프로필렌 파우더 퍼넬 ThermoFisher4252-0100
바늘 20 gaBecton Dickinson (BD)305175
Parafilm M - 유연한 필름Sigma-AldrichP7793-1EA
면도날Fisher Scientific12-640
스파튤라콜-파머EW-06369-18 
Steriflip 멸균 필터Fisher ScientificSE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS5-500
주사기 펌프New Era Pump Systems Inc.NE-1000
온도 플라스크 탁상용 액체 질소 용기ThermoFisher2122
, , , , , , Life

참고문헌

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530(2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

1 차 간세포 보존을 위한 대량 물방울 유리화
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.