Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Summary

설치류 모델과 관련된 기초 연구 과정에서 기능 평가를 수행하기 위해 4대의 카메라와 데이터 처리 소프트웨어가 포함된 3차원 모션 캡처 장치를 사용하는 운동학 분석 방법을 소개합니다.

Abstract

SCIATIC 기능 지수(SFI)와 비교하여 운동학 분석은 심막 신경 손상 설치류 모델의 기능적 평가를 수행하기 위한 보다 안정적이고 민감한 방법입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 쥐 심낭 신경 호감 상해 모델을 사용하여 기능 평가를 위한 3차원(3D) 모션 캡처 장치를 사용하는 새로운 운동학 분석 방법을 기술한다. 첫째, 쥐는 러닝머신 걷기에 익숙합니다. 마커는 지정된 뼈 랜드 마크에 부착하고 쥐는 원하는 속도로 러닝 머신에 걸어 만들어집니다. 한편, 쥐의 후방 사지 움직임은 4 개의 카메라를 사용하여 기록됩니다. 사용되는 소프트웨어에 따라 마커 추적은 자동 모드와 수동 모드를 모두 사용하여 생성되며 원하는 데이터는 미묘한 조정 후에 생성됩니다. 3D 모션 캡처 장치를 사용하는 이 운동 분석 방법은 뛰어난 정밀도와 정확도를 포함하여 다양한 이점을 제공합니다. 포괄적인 기능 평가 중에 더 많은 매개 변수를 조사할 수 있습니다. 이 방법에는 고려해야 할 몇 가지 단점이 있습니다: 시스템은 비용이 많이 들고 작동이 복잡할 수 있으며 피부 이동으로 인한 데이터 편차가 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 3D 모션 캡처 장치를 이용한 운동분석은 기능적 전방 및 후방 사지 평가를 수행하는데 유용하다. 미래에,이 방법은 다양한 외상과 질병의 정확한 평가를 생성하는 데 점점 더 유용해질 수 있습니다.

Introduction

SITIC 기능지수(SFI)는 기능성 심근 신경 평가를 수행하기 위한 벤치마크 방법입니다^1. SFI는 널리 채택되어 왔으며 쥐 심막 신경 상해^2,3,4,5,6에대한 다양한 기능 평가 연구에서 자주 사용된다. 그 인기에도 불구하고, SFI에 몇 가지 문제가있다, 자동 절단^{포함 7,}공동 계약 위험, 발자국의 얼룩⁸. 이러한 문제는 예후 값^9에심각하게 영향을 미칩니다. 따라서 SFI를 대신하기 위해 오류가 발생하기 쉬운 대체 방법이 필요합니다.

이러한 대체 방법 중 하나는 운동학 분석입니다. 여기에는 뼈가 있는 랜드마크 또는 관절에 부착된 추적 마커를 사용한 포괄적인 보행 분석이 포함됩니다. 운동학 분석은 기능 평가^9에점점 더 사용되고 있습니다. 이 방법은 SFI^11,12에기인하는 단점 없이 기능^{평가(10)를} 위한 신뢰할 수 있고 민감한 도구로 점진적으로 인식되고 있다.

이 프로토콜에서는 러닝머신, 4개의 120Hz 충전 결합 장치(CCD) 카메라 및 데이터 처리 소프트웨어로 구성된 3D 모션 캡처 장치를 사용하는 일련의 운동 분석(재료 표참조)을 설명합니다. 이러한 운동학 분석 방법은 일반적인 비디오 보행 또는 걸음걸이 분석^13,14와다릅니다. 두 대의 카메라가 서로 다른 방향으로 배치되어 한 쪽에서 후방 사지의 움직임을 기록합니다. 그 후, 후방 사지의 3D 디지털 모델은 컴퓨터 그래픽^9를사용하여 구성됩니다. 실제 팔다리 치수를 면밀히 관찰하여 엉덩이, 무릎, 발목 및 발가락 관절과 같은 지정된 관절 각도를 계산할 수 있습니다. 또한 보폭/스텝 길이 및 스탠스 위상과 스윙 단계의 비율 등 다양한 파라미터를 결정할 수 있습니다. 이러한 재구성은 두 세트의 카메라로 전송된 데이터에서 생성된 후방 팔다리의 완전히 재구성된 3D 디지털 모델을 기반으로 합니다. 가상의 무게 중심(CoG) 궤탄도 자동으로 계산할 수 있습니다.

우리는 이 3D 모션 캡처 장치를 사용하여 쥐 심낭 신경 호감 부상 모델의 맥락에서 시간이 지남에 따라 기능적 변화를 드러내는 여러 운동 학적 매개 변수를 소개하고 평가했습니다.

Protocol

이 프로토콜은 교토대학의 동물 실험 위원회의 승인을 받았으며, 모든 프로토콜 단계는 교토대학 동물 실험위원회의 지침에 따라 수행되었습니다(승인 번호: MedKyo17029).

1. 러닝머신 걷기로 쥐를 친숙해

1. 러닝머신 양쪽에 투명 플라스틱 시트 두 장을 설치하여 12주된 수컷 루이스 쥐가 직선, 정면 방향으로 걷게 한 다음 전기 충격 그리드를 켭니다.
2. 각 쥐가 러닝머신을 걷게 한다. 점차적으로 원하는 속도로 러닝 머신을 가속 (20cm / s 또는 12m / 분) 5 분 동안이 속도로 쥐가 정상적으로 걸을 수 있도록. 각 걷기 세션 후, 1-2 분 휴식을 제공합니다. 이 과정을 하루에 3회, 일주일에 5일, 1주일 동안 반복합니다.
   참고: 2단계 1주일 전에 러닝머신을 걷기 시작합니다.
3. 12 시간 밝은 어두운 주기와 케이지 당 3 의 그룹에 집 쥐와 그들에게 상업 쥐 음식과 수돗물 광고 리비텀을 공급.

2. 자골 신경 호감 부상을 수행

1. 마취 유도 챔버에 쥐를 배치하고 소개 5% 이소플루란 흡입 솔루션.
2. 0.15 mg/kg의 메데토미딘 염산염, 2 mg/kg 미다졸람, 2.5 mg/kg 의 부토판올 타르타르산염으로 제조된 복합 마취제의 복강 내 주사를 쥐에게 제공합니다. 페달 반사 신경의 부족을 확인합니다. 그런 다음 전기 면도기로 왼쪽 큰 트로텐더에서 허벅지 중간까지 영역을 면도합니다.
3. 무균 천 조각을 펼치고 쥐를 그 위에 놓고 왼쪽 측면 위치에 놓습니다. 멸균 수술기구도 천에 놓습니다.
4. 수술 번호 10 블레이드로 허벅지 중간에 큰 trochanter에서 직선 절개를 만듭니다. 그런 다음 사두근 femoris와 이두근 femoris 사이의 무딘 해부를 수행하여 수술 지혈제를 사용하여 심근 신경을 노출시다.
5. 두 쌍의 마이크로 포스로 주변 조직에서 심근 신경을 분리하고 표준 수술 지혈을 사용하여 10 초 동안 자골 신경을 분쇄하여 둔부 결절 바로 아래 부위에서 2mm 길이의 호감 손상을 만듭니다.
6. 한 쌍의 마이크로 포스셉을 사용하여 부상의 근위 쪽 끝에서 9-0 나일론 에피 뉴럴 스티치를 수행한 다음 4-0 나일론 봉합사로 근육과 피부를 닫습니다.
7. 쥐에 0.3 mg/kg 의 아티파메졸 염산염으로 제조 된 마취 길항제의 복강 내 주사를 제공하여 10 분 이내에 깨워. 쥐가 마취에서 회복 한 후, 쥐가 꼬리의 기저부에 의해 중단되는 동안 왼쪽 발가락의 움직임을 관찰하십시오. 발가락이 전혀 퍼지지 않으면 수술이 성공했습니다.
8. 12 시간 밝은 어두운 주기로 수술 후 개별적으로 쥐를 수용하고 그들에게 상업 쥐 음식과 수돗물 광고 리비텀을 공급.

3. 마커 부착

1. 마취 유도 챔버에 훈련 된 쥐를 배치하고 5 % 이소플루란 흡입 솔루션을 소개합니다. 발가락을 꼬집어 페달 반사가 없는지 확인합니다.
2. 쥐가 마취 마스크 (2 % 이소플루란 흡입 용액)를 사용하여 지속적으로 마취 될 수 있도록하십시오. 쥐가 안정된 마취를 받는 동안, 전기 면도기를 사용하여 허리에서 양측 malleoli로 영역을 면도하십시오.
   주의: 연구원이 누출된 이소플루란에 노출되는 것을 방지하려면 마스크가 쥐의 머리와 얼굴을 단단히 덮는지 확인하십시오.
   참고: 쥐의 부상을 방지하려면 모발을 가능한 한 부드럽게 면도하십시오.
3. 쥐를 쉬운 위치에 놓습니다. 면도 된 피부에 다음과 같은 뼈 랜드 마크를 표시 하는 검은 마커 펜을 사용 하 여: 요추에서 천골 척추에 가시 과정을 통해 라인, 전방 우수한 장골 척추, 큰 trochanters, 무릎 관절, 측면 malleoli, 다섯 번째 메타 토팔란게알 관절, 그리고 네 번째 발가락의 끝.
   참고: 가시 공정을 통과하는 선은 양측 마커가 축대칭인지 여부를 결정하는 데 사용됩니다.
4. 요추에서 성골 척추에 이르는 가루 과정을 통과하는 라인과 네 번째 발가락의 끝을 제외하고, 이러한 뼈 랜드마크에 반구형 마커를 부착하기 위해 액체 접착제를 사용합니다. 혼동을 피하기 위해 다른 모든 랜드마크에 대해 고유한 색상을 사용합니다. 네 번째 발가락의 끝은 분홍색 잉크로 표시됩니다.
   주의: 작업자의 노출된 피부에 접착제가 떨어지지 않도록 주의하십시오.
5. 모든 마커를 놓은 후 쥐를 케이지에 다시 넣습니다. 쥐가 마취에서 완전히 회복 될 때까지 러닝 머신에 쥐를 두지 마십시오.
   참고: 쥐가 마취에서 완전히 회복되지 않으면 의식이 저하되면 정상적인 보행에 심각한 영향을 줄 수 있습니다.

4. 교정 및 소프트웨어 설정

1. 러닝머신 양쪽에 투명 플라스틱 시트 2장을 설치하고 교정 상자를 러닝머신 중앙에 놓습니다. 녹화 소프트웨어를 연 다음 디스플레이의 보정 이미지 아이콘(보충파일 1)을클릭합니다.
2. 120Hz CCD 카메라를 사용하여 4방향에서 1~2초의 비디오를 녹화하려면 녹화 아이콘을 클릭합니다. 녹음/녹화 아이콘을 다시 클릭하여 녹화를 중지합니다.
   참고: 녹화가 중지되면 비디오가 자동으로 저장됩니다.
3. 계산 소프트웨어에서 비디오 파일을 엽니다. 화면 오른쪽 하단에 있는 교정 상자 3D 모델의 특성 점을 클릭하고 드래그하여 교정패턴(보조 파일 2)의비디오에서 자동으로 변환되는 4개의 그림의 해당 마커로 이동합니다. 그런 다음 저장 아이콘을 클릭합니다.
   참고: 교정이 완료된 후 카메라의 위치를 변경하지 마십시오.

5. 걷기 녹음

1. 러닝머신에서 교정 상자를 꺼내 전기 충격 그리드를 켜고 완전히 깨어있는 쥐를 러닝머신에 놓습니다. 레코딩 소프트웨어를 열고 일련 번호, 보행 속도 및 주 운영자의 이름을 포함하여 쥐에 대한 기본 정보를 입력합니다.
2. 러닝머신을 켜고 속도를 20cm/s로 설정합니다. 쥐가 속도에 적응하고 정상적으로 걸을 수 있게 되면 디스플레이의 녹음 아이콘을 클릭하여 4대의 카메라로 걷는 쥐를 기록합니다. 충분한 단계가 기록되면 (>10), 녹음을 중지하고 러닝 머신을 해제하려면 아이콘을 다시 클릭합니다.
   참고: 녹화가 중지되면 비디오가 자동으로 저장됩니다.
3. 마취 를 위해 마취 유도 챔버에 다시 쥐를 넣어. 쥐가 지속적인 마취 (마취 마스크를 통해 투여)를 받고있는 동안, 반구형 마커를 제거합니다.
   참고: 쥐에 통증을 일으키지 않도록 마커를 가능한 한 부드럽게 제거하십시오.
4. 지정된 시간(예를 들어, 수술 후 1주, 3주 또는 6주)에서 3.1-5.3단계를 반복하여 랫트에 대한 운동학적 측정을 수행한다. 수술을 받지 않은 쥐(즉, 대조군)에 대해 실험 초기에 운동학 측정을 한 번만 합니다.

6. 마커 추적

1. 계산 소프트웨어를 열고 인터페이스에서 비디오 파일을 엽니다.
2. 비디오의 진행률 표시줄에서 양측 제어 막대를 클릭하고 드래그하여 10단계 러닝머신 걷기 기록만 표시되도록 합니다(보조파일 3). 화면 오른쪽 하단에 있는 3D 모델에서 카메라로 촬영한 동영상의 초기 사진 4개 각각에 해당하는 마커로 각 특성 점을 클릭하고 드래그합니다(보조파일 4).
3. 자동 마커 추적 프로세스를 시작하려면 자동 추적 아이콘을 클릭합니다(보조 파일5, 보조 파일 6). 시스템에서 마커를 정확하게 추적하지 않으면 수동으로 디지털화 아이콘을 클릭하여 수동 추적 모드(보조파일 7)로전환한 다음 3D 모델의 추적 특성 점을 클릭한 다음 그림의 응답 마커를 클릭합니다.
4. 마커를 클릭하면 그림이 비디오의 다음 프레임으로 전환되었는지 확인합니다. 이제 마커 추적 프로세스가 완료될 때까지 마커를 계속 클릭합니다. 완료되면 저장 아이콘을 클릭합니다.

7. 운동분석

1. 분석 소프트웨어를 연 다음 인터페이스에서 처리된 비디오 파일을 엽니다.
2. 설정 아이콘을 클릭하고 발목 각도, 발가락 각도 및 골반 시프트(X 및 Z 축)와 같은 지정된 매개변수를 오른쪽팝업 창의 표시 목록에 추가합니다(보조파일 8). 확인을클릭하면 매개 변수의 값 변경을 나타내는 곡선이 인터페이스에 나타납니다.
3. 측정 아이콘을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 부드러운 처리를 선택합니다. 팝업 창에 20Hz를 입력하여 곡선 내에서 20Hz보다 큰 주파수를 제거합니다(보조파일 9).
4. 인터페이스에 5개의 패널이 있는지 확인합니다: 쥐의 도보 비디오, 동적 3D 모델, 10단계 주기의 매개변수의 값 변화를 나타내는 곡선, 매개변수의 평균 값 변경을 나타내는 곡선, 자세및 스윙 단계의 비율을 나타내는 히스토그램 및 회로도(보충파일 10).
5. 매개변수의 평균 값 변경을 나타내는 곡선의 패널을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 풀다운 메뉴에서 데이터 출력을 선택합니다(보충파일 11). 이것은 발목과 발가락 각도, 골반 시프트 및 10 단계 주기 기간에 있는 그밖 원하는 매개변수를 포함하여 후방 사지 합동 각도의 평균 값을 생성할 것입니다.

Results

우리는 쥐 심막 신경 호감 상해 모형에 있는 시간 지남에 따라 기능적인 변경을 조사하기 위하여 4개의 매개변수를 선택했습니다. 이는 '발가락 오프' 단계^9의자세 대 스윙 위상, 중심(CoG) 궤적, 발목 각도 및 발가락 각도의 비율이었습니다. 24마리의 쥐를 무작위로 4개의 그룹 중 하나에 배정하였다: 대조군(C), 첫 번째(1w), 3위(3w), 및 여섯 번째(6w) 주에 좌측 좌측 좌측 좌측 신경 호감 부상.

3D 운동학 분석을 통해 10단계 사이클에서 자세 또는 스윙 단계의 평균 비율이 자동으로 계산되어 인터페이스상에 표현되었습니다(그림1A-D). 우리는 자세 대 스윙 단계의 비율이 수술 후 회복되었다는 것을 발견했습니다.

CoG는 3D 모션 캡처 장치에 의해 가상 마커로 추적할 수 있는 가상 포인트...

Discussion

이 프로토콜에서 안정적이고 지속적으로 걷는 쥐는 운동학 분석의 가장 중요한 구성 요소입니다. 러닝머신 속도는 20cm/s로 설정되었습니다. 이 보행 속도는 결코 "높음"으로 간주되지 않으며 쥐가 공간 제약 없이 움직이면^16. 그럼에도 불구하고, 이 속도는 훈련되지 않은 쥐가 러닝머신에서 안정적으로 걸을 수 없을 정도로 빠르며 비정상적인 걸음걸이와 불균일한 움직임을 초래할 수 있습니다. 이러한 이벤트는 데이터 안정성및 신뢰성에 심각한 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 러닝머신 의 속도가 20cm/s보다 낮으면 쥐가 간헐적으로 걷는 것을 멈추고 큰 편차가 발생하고 데이터 신뢰성이 저하될 수 있습니다. 따라서, 러닝머신에서 직선, 정면 방향으로 꾸준히 걸을 수 있도록 쥐를 훈련시키는 것은 정밀한 운동학 분석을 달성하는 것이라면 매우 중요하다.

또한 작업자는 운동 분석 프로세스 중에 재확인 및 미세 조정에 대한 요구를 무시해서는 안 됩니다. 우리...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
9-0 나일론 봉합	베어 메딕 코퍼레이션.	T06A09N20-25
소동물용 마취기구	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
이소플루란 흡입 용액	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
Kine Analyzer	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	해당 없음	해석 소프트웨어
액상 접착제	KANBO PRAS CORPORATION	PT-B180
마이크로 겸자	BRC CO.
모션 레코더	KISSEI COMTEC CO., LTD.	해당 없음	녹음 소프트웨어
표준 수술용 지혈제	Fine Science Tools, Inc.	12501-13
수술용 칼날 No.10	FEATHER Safety Razor CO., LTD	100D
수술용 지혈	세계 정밀 기기	503740
3차원 모션 캡처 장치(동물용 KinemaTracer)	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	해당 없음	카메라로 구성된 3D 모션 해석 시스템입니다
입체(3D) 계산기	KISSEI COMTEC CO., LTD.	해당 없음	마커 추적 소프트웨어
디딜방아	MUROMACHI KIKAI CO., LTD	MK-685	전기 쇼커, 투명 요트 및 속도 제어 장치와 제휴 된 디딜 방