방법 논문

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

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DOI:

10.3791/60299

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2019년 11월 6일

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2MOE Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Institute of Life Sciences, Southeast University

이 논문에서

요약

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

초록

달팽이관의 청각 처리는 메카노 감각 모발 세포의 무결성에 달려 있습니다. 일생 동안, 청력 손실은 과도한 소음에 노출, 이독성 약물의 사용, 세균 또는 바이러스 성 귀 감염, 머리 부상 및 노화 과정과 같은 수많은 병인에서 취득 될 수있다. 감각 모발 세포의 손실은 획득 한 청력 손실의 품종의 일반적인 병리학 적 특징입니다. 또한, 내부 모발 세포 시 냅 스 가벼운 모욕에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서, 달팽이관 상피의 표면 제제는, 면역 표지 기술 및 공초점 이미지와 함께, 리본 시냅스와 감각 모발 세포의 손실을 포함하여 달팽이관 병리의 조사에 매우 유용한 도구입니다, 모발 세포의 단백질 수준 변화 및 지원 세포, 모발 세포 재생 및 보고서 유전자 발현 (즉, GFP)의 결정은 성공적인 트랜스덕션의 검증 및 형질전환 세포 유형의 식별을 위한 것입니다. 달팽이관, 내이에 뼈 나선형 모양의 구조, 청각 감각 말단 기관, 코르티의 기관을 보유 (OC). OC에 있는 감각 머리 세포 및 주변 지지 세포는 달팽이관 덕트에 포함되고 바실라 막에 휴식, 정점에 있는 기지 및 저주파에서 일어나는 고주파 검출을 가진 tonotopic 방식으로 조직됩니다. 분자 및 유전 정보의 가용성과 녹아웃 및 노크 인 기술에 의해 유전자를 조작 할 수있는 능력으로, 마우스는 청각 과학을 포함한 생물학적 연구에 널리 사용되어왔다. 그러나, 성숙한 마우스 달팽이관은 아주 작기 이고, 달팽이관 상피는 뼈 미로에서 캡슐화되고, microdissection을 어렵게 만듭니다. 많은 실험실에서 해부 기술이 개발되고 사용되었지만, 세포 및 조직 접착제를 사용하는 이 변형된 미세 해부 방법은 더 쉽고 편리합니다. 그것은 decalcification 다음 성인 마우스 달팽이관의 모든 유형에 사용할 수 있습니다.

서론

달팽이관은 소리 감지에 전념하고 청력을 담당합니다. 달팽이관 덕트뼈 미로에 나선형 모양으로 코일 및 청각 감각 끝 기관, 코르티의 기관을 보유 (OC). OC는 달팽이관 막에 달려, 성인 CBA/CaJ 마우스에서 풀어 때 대략 5.7 mm의 길이를 가진 달팽이관 상피를구성합니다 1,2. OC는 정점의 베이스에서 검출된 고주파와 낮은 주파수로 비공식적으로 구성되기 때문에, 달팽이관 상피는 종종 분석 비교를 위해 세 부분으로 나뉩니다: 낮은 에 상응하는 정점, 중간 및 기저 회전, 각각 고주파 검출을 할 수 있습니다. 지지 세포의 배열 이외에, OC는 달팽이관 나선형에 대하여 측면으로 위치한 내측 및 외부 모발 세포 (OHCs)의 3 행에 위치한 내부 모발 세포 (IHCs)의 한 행으로 구성된다.

올바른 청각 처리는 달팽이관의 감각 모발 세포의 무결성에 달려 있습니다. 감각 모발 세포의 손상 또는 손실은 과도한 소음에 노출, 이독성 약물의 사용, 세균 또는 바이러스 성 귀 감염, 머리 부상 및 노화와 같은 수많은 병인으로 인한 후천성 청력 손실의 일반적인 병리학 적 특징입니다. 프로세스3. 또한, 내부 모발 세포 / 청각 신경 시냅스의 무결성과 기능은 가벼운 모욕에 의해 손상 될 수있다4. 분자 및 유전 정보의 가용성과 녹아웃 및 노크 인 기술에 의한 유전자 조작으로 마우스는 청력 과학에서 널리 사용되어 왔습니다. 성인 마우스 달팽이관은 소문자이고 달팽이관 상피는 기술적으로 어려운 미세 내부, 면역 표지 또는 면역 조직 화학과 조합하여 상피의 표면 제제의 결과로 뼈 캡슐에 둘러싸여 있지만 및 공초점 이미지는 광범위하게 달팽이관 병리의 조사를 위해 사용되었습니다, 리본 시냅스와 모발 세포의 손실을 포함, 감각 모발 세포와 지원 세포에서 단백질의 수준의 변화, 및 모발 세포 재생. 달팽이관 표면 제제는 또한 리포터 유전자(즉, GFP)의 발현 패턴을 결정하고 성공적인 트랜스덕션을 확인하고 형질전환 세포 유형을 식별하는 데 사용되어 왔다. 이러한 기술은 이전에 성인 CBA/J 마우스5,6,7,8,9를사용하여 소음 유발 난청을 기초로 하는 분자 메커니즘의 연구에 사용되어 왔다.

파라핀 절편이나 극저온절을 이용한 면역조직화학과는 달리 각 섹션에 3개의 외부 모발 세포(OHCs)와 1개의 내부 모발 세포(IHC)를 포함하는 달팽이관의 작은 단면 부분을 얻을 수 있으며, 달팽이관 표면 제제는 특정 기능적 주파수에 대응하는 감각 모발 세포 및 리본 시냅스와 면역 라벨링을 계수하기 위한 OC의 전체 길이를 시각화합니다. 표 1은 뮬러1과 비버그 및 캔론1,2의연구에 따른 성인 CBA/J 마우스에서 달팽이관 나선형의 길이를 따라 거리 의 함수로서 청각 주파수의 매핑을 나타낸다. 달팽이관 표면 제제는 달팽이관 병리의 조사를 위해 널리 이용되었습니다4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. 전체 마운트 달팽이관 해부 방법은 원래 1966년 16에서 한스 엥스트롬에 의해 편집 된 책에 설명되었다. 이 기술은 이후 과학10,11,12,13,청각 과학의 다수의 과학자들에 의해 문헌에 기술된 바와 같이 다양한 종에 정제및 적응되었다. 15,17 및 매사추세츠 눈과 귀18에서이튼 - 피바디 연구소에 의해 . 최근, 또 다른 달팽이관 해부 방법은 몽고메리 외19에의해 보고되었다 . 달팽이관의 미세 해부는 달팽이관 표면 준비를 위한 필수적이고 중요한 단계입니다. 그러나 마우스 달팽이관 해부는 기술적인 과제이며 상당한 연습이 필요합니다. 여기서, 변형된 달팽이관 표면 제제 방법은 성인 마우스 달팽이관에서 사용하기 위해 제시된다. 이 방법은 면역 라벨링을 위해 10 mm 라운드 커버슬립에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위해 세포 및 조직 접착제 (즉, Cell-Tak)의 decalcification 및 사용을 요구합니다. 세포 및 조직 접착제는면역조직화학(20)에널리 사용되고 있다. 이러한 수정된 달팽이관 미세해부 방법은 이전에 보고된18,19에비해 비교적 간단하다.

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프로토콜

10-12주 및 6-8주 연령대의 C57BL/6J 마우스의 연령대에 남성 성인 CBA/J 마우스와 관련된 모든 연구 프로토콜은 사우스캐롤라이나 의과 대학(MUSC)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다. 동물 관리는 MUSC에서 실험실 동물 자원의 부서의 감독하에 있었다.

참고: 아래에 제시된 절차의 경우, 마우스는 피하 주사를 통해 케타민 (100 mg/kg)과 자일라진 (10 mg /kg)으로 마취됩니다. 마우스는 동물이 더 이상 발가락 핀치와 같은 고통스러운 자극에 반응하지 않는 후에 참수됩니다.

1. 현세적 뼈의 추출

  1. 수술용 가위로 마우스를 즉시 사후 처리(17cm 길이)하고 두개골 뼈를 앞쪽으로 당겨 두개골 뼈를 노출한 후 두개골 의 중심선을 따라 후방 측면에서 가위로 두개골 뼈를 잘라냅니다.
  2. 포셉을 사용하여 뇌 조직을 제거하고 생쥐의 3개월 이상에 대해 엄지와 검지로 측두뼈를 수동으로 제거합니다. 생후 3개월 미만의 쥐의 측두골을 자르기 위해 작은 수술용 가위(길이 11cm)를 사용하십시오.
  3. 인산완충식염수(PBS), pH 7.4에 용해된 얼음냉이의 신선한 4% 파라포름데히드(PFA) 용액을 함유한 페트리 접시(직경 30mm)에 측두골을 넣습니다.
    참고: PFA 용액의 부적절한 pH 밸런싱이 면역 표지의 품질을 저하시키기 때문에 신선한 4% PFA 용액을 준비하고 시간적 뼈를 고정하기 직전에 pH를 7.4로 조절한다.

2. 고정 및 관류

  1. 타원형 창에서 테이프를 제거하고 크기 #5 집게로 둥근 창 막에 구멍을 뚫습니다. 스테레오 해부 현미경에서 1 mL 주사기에 연결된 27G 바늘을 사용하여 달팽이관의 정점에 작은 구멍을 만듭니다.
  2. 용액이 정점의 작은 구멍에서 클렌스될 때까지 원형 및 타원형 창을 통해 4% PFA 용액으로 달팽이관에 부드럽게 천천히 침투합니다. 달팽이관(바이알당 1개 또는 2개의 달팽이관)을 4% PFA 용액의 10 mL를 함유하는 20 mL 부피 섬광 바이알로 옮니다.
  3. 실온(RT)에서 2시간 동안 번광 바이알을 부드럽게 교반하고 회전자의 냉장고(4°C)에 밤새 둡니다.
    참고: 고정 시간은 사용되는 항체에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 고정을 1.5h로 제한하면 GluA 2 항체를 사용할 때 시냅스 후 말단의 성공적인 면역 라벨링이 허용됩니다.

3. 현두 뼈의 데칼화

  1. PFA 용액을 제거하고 신선한 PBS 3x로 달팽이를 각각 5분 동안 세척합니다.
  2. 20 mL의 4% 에틸렌디아미네테트라아세트산 이나트륨 염(EDTA) 용액(pH 7.4)을 번들로 된 바이알에 넣고 부드러운 교반을 가진 회전자위에 48-72시간 동안 냉장고에 보관하십시오. 달팽이관이 탈석될 때까지 EDTA 용액을 매일 변경합니다. 달팽이관이 탄력성을 평가하기 위해 집게로 뼈 전정 부분을 만져서 decalcified되어 있는지 확인하거나 단순히 전정 부분의 가장자리에서 작은 조각을 잘라. 이러한 절단으로 인해 분쇄 된 조각이 발생하면 달팽이관이 decalcified되지 않습니다.
    참고: EDTA 용액은 용액 농도에 따라 1차 항체의 면역반응을 방해할 수 있다. PBS에서 4% EDTA를 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 시간 뼈의 일관된 decalcification을 위해, 신선한 EDTA 용액이 사용됩니다.
  3. 탈균이 완료된 후 미세 해부에 대한 용액을 PBS로 변경합니다.
    참고: 달팽이관이 충분히 탈석되지 않으면 달팽이관의 해부를 수행 할 수 없습니다.

4. 달팽이관 상피의 미세 해부

참고: 일단 decalcification가 완료되면, 면역 표지를 위한 달팽이관 상피의 미세 한 해부는 가능한 한 빨리 수행될 필요가 있습니다. PBS를 포함하는 깨끗한 30mm 페트리 접시에서, 내이는 다음과 같은 방식으로 지향된다 : 페트리 접시의 상단 (뚜껑)과 하단을 참조, 달팽이관 둥근 타원형 창은 상단을 향합니다. 섹터를 참조하여 달팽이관 부분은 앞쪽(분리구역에서 멀리) 및 전정 부분을 뒤쪽(디스섹터 근처)을 향합니다. 다음은 단계에 대해 자세히 설명합니다.

  1. 검지로 측두골의 전정 부분을 잡고 빨간색 선으로 표시된 대로 메스로 정점 회전을 45° 각도로 잘라냅니다(그림1a).
  2. 둥근 창과 타원형 창 사이의 희미한 선을 따라 수직으로 자르고, 빨간색 선으로 표시된대로(도 1b)전정 부분으로부터 달팽이를 분리한다(도1c).
    참고: 이 달팽이관 부분은 상피의 중간, 기저 및 후크 부분을 포함합니다.
  3. 달팽이관 부분을 밑면으로 돌리고 가운데를 페트리 접시의 위쪽으로 돌리고 중간 의 뼈 캡슐과 측면 벽을 잘라 서 적단이 제거된 끝으로, 빨간색 선(Figu)으로 표시된 대로 다시 1d,e).
  4. 기저 및 후크 영역으로부터 중간 부분을 완전히 분리하기 위해 절단을 계속합니다(그림1f,g).
    참고: 달팽이관의 후크 영역은 48 kHz의 톤에 대한 민감도에 대응하는 달팽이관 상피의 말단이며 마우스에서 더 높다.
  5. 기저 및 후크 부분을 접시의 바닥을 향지하는 바실러 멤브레인 부위를 넣고 후크 부위에서 모디올루스를 수직 적색 선으로 표시된 대로 제거하여 후크 부위에서 수직으로 잘라냅니다(도1g).
    참고: 모디올루스는 해면질 뼈와 달팽이관 신경뿐만 아니라 나선형 신경절로 구성된 달팽이관의 원추형 중앙 축입니다. 가위로 이 컷을 수행하는 것이 바람직할 수 있습니다.
  6. 도 1g에서 다른 빨간색 선이 나타내는 대로 기저 및 후크 영역을 잘라 후크 부분을 분리한다(도1시간).
    참고: 달팽이관은 이제 상체, 중간, 기초 및 후크 부분으로 분리되었습니다. 다음 단계는 중간 회전을 예로 사용하여 각 개별 회전의 마지막 해부입니다.
  7. 중간 회전의 뼈 캡슐 및 측면 벽 조직의 비교적 큰 부분을 잘라 적색 선으로 표시된 대로(도 1i).
    참고: 달팽이관의 측면 벽은 나선형 인대와 줄무늬 혈관에 의해 형성됩니다.
  8. 집게로 측면 벽을 잡고 뼈 캡슐과 측면 벽을 페트리 접시의 바닥과 정렬하고 바실라 멤브레인 측에서 이러한 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 시편을 평평하게 하여 감각 모발 세포 표면측면을 위로 향하게 한다. 뼈 캡슐과 측면 벽의 나머지 부분을 잘라내십시오(그림1j).
  9. 집게를 이용하여 지각막을 제거하여 중간 영역을 완전히 분리하였다(도1k).
  10. 그림 1l에나타난 바와 같이 나머지 회전 또는 영역의 최종 해부에 대해 4.7-4.9 단계를 반복합니다.
  11. 감각 상피의 부착을 위해 10mm 원형 커버슬립을 준비합니다. 원형 커버슬립 중앙에 0.5 μL의 세포와 티슈 접착제를 손으로 퍼뜨리기 위해 파이펫을 사용합니다. 건조 후 (RT에서 3-5 분), 페트리 접시에 PBS에 커버 립을 넣어.
  12. 페트리 접시에 있는 10mm 원형 커버슬립에 감각 상피 4개를 모두 붙입니다. 그런 다음 커버슬립의 한 쪽 가장자리를 잡고 면역 표지 또는 면역관질화학을 위한 4웰 접시로 옮김(도1m)을전달한다.
    참고: 그림 2는 주요 컷의 위치를 보여 줍니다.

5. 달팽이관 시냅스를 위한 면역 표지

참고: 본 연구에서 선행된 달팽이관 시냅스를 위한 면역 표지를 위한 프로토콜은 이전에13에기술되었다. 시냅스 전 리본은 CtBP2 항체(마우스 항-카르복실 말단 결합 단백질 2 IgG1, RIBEYE 스캐폴딩 단백질의 B 도메인에 라벨링)로 표지되었다. 시냅스 후 단말은 GluA2 항체(마우스 항글루타민산 수용체 2 IgG2a, AMPA 수용체의 소단위 표지)로 표지되었다.

  1. 감각 상피를 PBS 3x로 5분 동안 4웰 접시에 씻은 다음 2% nonionic 계면활성제(즉, 트리톤-X 100)의 2 mL을 회전자에서 RT에서 30분 동안 접시에 넣습니다.
  2. 파이펫을 사용하여 접시에서 난오계면활성제 용액을 제거하고 RT에서 부드러운 교반을 가진 로터에서 1시간 동안 10% 정상 염소 혈청을 함유하는 차단 용액을 각각 100 μL을 추가합니다.
  3. 각 우물에서 차단 용액을 제거하고 RT에서 부드러운 교반하에 각 세척시 5 분 동안 PBS 3x로 씻으하십시오.
  4. 각각의 우물에 PBS로 희석된 1차 항체의 100 μL을 첨가한다: 마우스 안티글루A2 IgG2a (1:2,000), 마우스 안티-CtBP2 IgG1(1:400). 뚜껑을 덮고 빛으로부터 보호하는 대형 가습 용기에 4개의 잘 깔진 접시를 덮습니다. 24 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
    참고: 옵션으로, 면역표지 감각 모발 세포에 대한 토끼 항미오신 VIIa(1:400)를 첨가할 수 있다.
  5. RT에서 부드러운 교반으로 5 분 동안 PBS로 3 x를 씻으소서.
  6. 100 μL의 이차 항체 알렉사 594 염소 항 마우스 IgG1a (1:1,000), 알렉사 488 염소 반대로 마우스 IgG2a (1:1,000) 각각의 웰에 PBS로 희석. 뚜껑을 덮고 빛으로부터 보호하는 대형 가습 용기에 4개의 잘 깔진 접시를 덮습니다. 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
    참고: 미오신 VIIa를 사용하는 경우, 알렉사 350 염소 안티 토끼를 추가 (1:200).
  7. PBS로 3x를 5분 동안 씻으소서. 그런 다음 10mm 원형 커버슬립을 샘플을 맨 위에 있는 슬라이드에 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다.
  8. 트리스 버퍼가 있는 플루오로 젤 8 μL을 커버슬립 중앙에 조심스럽게 넣습니다. 그런 다음 포셉이 있는 또 다른 10mm 원형 커버슬립의 가장자리를 상단에 장착하고 두 개의 커버슬립을 함께 끼워 넣습니다.
  9. 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉하고 골판지 슬라이드 폴더에 넣고 냉장고에 보관하십시오.
    참고: 장착 하는 동안 커버 슬립 사이 일부 Fluoro-Gel 누출 하는 경우, 매니큐어로 슬라이드를 밀봉 하기 전에 커버 슬립의 가장자리를 청소. 공초점 이미지는 7일 이내에 촬영해야 합니다.

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결과

달팽이관 상피의 표면 제제는, 면역 표지 및 공초점 화상 진찰과 결합하여, 리본 시냅스의 정량화, 감각 모발 세포의 정량화와 같은 달팽이관 병리의 조사를 위해 청각 과학에서 광범위하게 사용되었습니다, 감각 모발 세포에서 단백질 발현5,6,7,8. 표면 준비를 위한 성인 마우스 달팽이관의 해부는 간단하지 않지만, 신입생은 10-15 귀로 연습 한 후이 수정 된 방법을 배울 수 있습니다(그림 1 및 그림 2). 이 기술을 사용하여 CtBP2 (시냅스 전 리본의 마커) 및 GluA2 (시냅스 후 단말의 마커)에 대한 면역 라벨링과 함께 0.25 μm 간격으로 Z 프로젝션 하에서 공초점 이미지를 사용하여...

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토론

면역 라벨링과 함께 전체 마운트 표면 제제의 달팽이관 미세 해부는 내이 병리 및 분자 메커니즘을 조사하는 기본 도구를 제공합니다. 이러한 변형된 성체 마우스 달팽이관 해부 방법은 세포 및 조직 접착제를 사용하여 이러한 어려운 절차를 단순화한다.

이 수정된 달팽이관 표면 준비 방법은 비교적 쉽고 접근하기 쉽지만 숙련도를 달성하기 위해서는 여전히 연습이 필요합니다. 올바른 컷을 만들기 위해, 구역은주의 집중이 필요합니다. 기저 선도의 달팽이관 감각 모발 세포는 나선형 사지에 너무 가깝기 때문에 표면 준비를 완전히 평평하게 할 수 있도록 팔다리 조직을 완전히 제거하기는 어렵지만 공초점 Z-프로젝션은이 문제를 보상 할 수 있습니다. 또한 달팽이관의 후크 영역은 여전히 해부하기가 가장 어려운 부분입니다. 후크 영역의 OHCs와 IC 간의 분리가 발생할 수 있습니다. 후크 영역은 인간에서 큰 해부학 적 변화를 표시하고 뼈 전도 청력22,<...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

설명된 연구 프로젝트는 청각 장애 및 기타 통신 장애에 대한 국립 연구소, 건강의 국립 연구소에서 보조금 R01 DC009222에 의해 지원되었다. 이 작업은 보조금 C06 RR014516에 의해 지원 되는 개조 된 공간에서 MUSC의 WR 건물에서 수행되었다. 동물은 국립 연구 자원 센터의 교외 연구 시설 프로그램에서 보조금 C06 RR015455에 의해 지원 MUSC CRI 동물 시설에 보관되었다. 저자는 그의 귀중한 의견에 대한 박사 요헨 샤흐트 감사와 원고의 교정 안드라 탈라스카.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10mm Rund Coverslips현미경 제품260367
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG2Thermo Fisher ScientificA-21131
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgG1Thermo Fisher ScientificA-21125
Alexa Fluor 594 염소 안티 토끼 IgG (H + L)Thermo Fisher ScientificA11012
카보드 마이크로 슬라이드 트레이Fisher Scientific12-587-10
Cell-TakBD Biosciences354240
Corning Petri DishesFisher Scientific353004
DAPIThermo Fisher Scientific62247
Dumont # 5 ForcepsFST fine science tools11251-20
EDTA Disodium SaltSigma-AldrichE5134
Fluoro-gel with Tris BufferElectron Microscopy Sciences17985-10
4웰 세포 배양 접시Greiner Bio-One627170
Goat Anti-myosin VIIa 항체Proteus Biosciences25-6790
현미경 슬라이드Fisher Scientific12-544-7
마우스 Anti-CtBP2 항체BD Biosciences#612044
마우스 Anti-Glu2R 항체MilliporeMAB397
일반 염소 혈청Thermo Fisher Scientific31872
파라포름알데히드Sigma-Aldrich441244
Buffered SalineFisher ScientificBP665-1
메스VWR100491-038
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Vannas 스프링 가위파인 사이언스 도구15001-08
과학 및 산업용

참고문헌

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