CAL-1 혈장세포세포주에서 내인성 인터페론 조절 인자 5 이량화를 분석하기 위한 네이티브 웨스턴 블롯 방법이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 다른 세포주에도 적용될 수 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응을 조절하기 위한 주요 전사 인자이다. 그것은 톨-유사 수용체 골수성 분화 1차 반응 유전자 88(TLR-MyD88) 신호 통로의 하류로 활성화된다. IRF5 활성화는 세포질에서 핵으로의 인산화, 이량화 및 후속 전좌를 수반하며, 이는 차례로 다양한 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 유도한다. IRF5 활성화를 위한 검출 분석은 IRF5 기능 및 관련 경로를 연구하는 데 필수적입니다. 본 문서에서는 CAL-1 인간 혈장세포 수지상세포(pDC) 라인에서 내인성 IRF5 활성화를 검출하는 강력한 분석법들을 기술한다. 이 프로토콜은 단량체 및 이량체 형태로 IRF5를 구별할 수 있는 변형된 비분진 전기 동공 분석법으로 구성되어 IRF5 활성화를 분석하는 저렴하고 민감한 접근 방식을 제공합니다.
서론
인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응 조절에 중요한 전사 조절제이며, 특히 염증성 사이토카인 및 I형 인터페론(IFN)의 방출에서 특히 두드러진 역할을합니다. ,3. IRF5의 오질은 전신 성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 등과 관련된 IRF5 궤적의 다양한 다형성에 의해 명백한 바와 같이 수많은 자가면역 질환에 기여하는 요인입니다4. 5,6,7,8,9,10. 따라서, 내인성 IRF5 활성화 상태에 대한 강력한 검출 분석은 생리학적으로 관련된 세포 맥락에서 IRF5의 조절 경로 및 다운스트림 효과를 이해하는 데 매우 중요하다.
IRF5는 ....
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프로토콜
참고: 여기서 설명된 프로토콜은 TLR7/8의 작용제인 resiquimod(R848)로 처리된 CAL-1 pDC 세포주를 사용합니다. 본 프로토콜은 RAW 264.7(뮤린 대식세포선), THP-1(인간 단핵세포주), BJAB(인간 B 세포주), 라모스(인간 B 세포주), 및 MUTZ-3(인간 수지상세포주)를포함하는 다른 인간 및 뮤린 세포유형에 적용되었다.
1. CAL-1 세포의 자극
- 37°C에서 T75 플라스크에서 CAL-1 세포 배양물을 37°C및 5%CO2의 멸균 조건에서 RPMI 1640 배지의 5% 태아 소 혈청(FBS), 25 mM HEPES 및 1x 메르카프토에탄올(즉, 완전한 RPMI 1640 배지)을 함유합니다.
- 세포를 50 mL 원엽 튜브로 옮김.
참고: CAL-1 세포는 부착되지 않습니다. 부착 세포 유형의 경우, 표준 트립시니화는 세포를 수확하기 위해 수행 될 수있다. - 실온(RT)에서 5분 동안 200 x g의 세포를 원심분리합니다. 상온액을 제거하고 완전한 RPMI 1640 배지의 8 mL에서 세포 펠릿을 재중단하여 균일한 ....
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결과
항-IRF5 항체를 가진 면역블롯(IB)을 2시간 동안 1 μg/mL R848로 자극하거나 자극하지 않은 CAL-1 세포상에서 수행하였다(도1). 세포 리세이츠를 제조하였고, 네이티브 PAGE를 수행하였다. 자극되지 않은 CAL-1 세포에서, IRF5는 네이티브 PAGE상에서 단일 대역으로서 검출되었고, 그 단일체형 형태에 상응하였다. 2 시간 동안 R848로 CAL-1 세포를 치료하면 IRF5 단량체의 수준은 IRF5의 디메라 형태에 상응하는 천천히 이동하는 밴드의 축적의 동시 증가와 함께 감소하였다.
그림 1: TLR7/8 작용제로 자극했을 때 CAL-1 세포에서 내인성 IRF5이 이량화되었다.
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토론
여기서 설명된 프로토콜은 내인성 IRF5의 단일및 다이메라체 형태를 모두 구별하는 수정된 네이티브 PAGE이다. 전문 적인 화상 진찰 교류 세포분석 기술23,27,28,30를사용하여 내인성 IRF5 활성화의 검출을 보고하는 몇몇 연구 결과가 있었습니다. 이 프로토콜은 일반적인 기술과 일반적인 시약 및 도구를 사용하여 활성화의 초기 이벤트 동안 내인성 IRF5 활성화 상태를 평가합니다. 이 프로토콜은 IRF5의 단일체체 형태와 디메릭 형태를 구분할 수 있도록 표준 네이티브 PAGE 프로토콜을 간단하게 수정해야 합니다. 다른세포주(23)를이용한 연구에 쉽게 적응할 수 있다. 이러한 변형된 네이티브 PAGE 프로토콜은 비특이적 단백질 간섭 없이 두 가지 형태로 내인.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 크라우처 재단과 시티 대학교 스타트업 기금의 기금으로 지원되었습니다. 우리는 실험과 원고의 비판적 독서에 도움을 차우 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토에탄올 | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V 전원 공급 장치 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 항체 | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (Cold Room Safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL | Life Technologies | ||
| 글리세롤 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt 프로테아제 억제제 칵테일 (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; 전송 모듈, 액세서리 | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% 겔, 10웰 키트 | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/ Calbiochem, HK# | 492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| 단백질 분석 키트 II(BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | ||
| 염화나트륨 | ThermoFisher | BP358-1 | |
| 나트륨 데옥시콜레이트 ≥ 97% (적정) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
참고문헌
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that....
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