방법 논문

내인성 IRF5 이분화의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동동면역블롯 분석

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DOI:

10.3791/60393

⸱

2019년 10월 6일

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong

이 논문에서

요약

CAL-1 혈장세포세포주에서 내인성 인터페론 조절 인자 5 이량화를 분석하기 위한 네이티브 웨스턴 블롯 방법이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 다른 세포주에도 적용될 수 있습니다.

초록

인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응을 조절하기 위한 주요 전사 인자이다. 그것은 톨-유사 수용체 골수성 분화 1차 반응 유전자 88(TLR-MyD88) 신호 통로의 하류로 활성화된다. IRF5 활성화는 세포질에서 핵으로의 인산화, 이량화 및 후속 전좌를 수반하며, 이는 차례로 다양한 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 유도한다. IRF5 활성화를 위한 검출 분석은 IRF5 기능 및 관련 경로를 연구하는 데 필수적입니다. 본 문서에서는 CAL-1 인간 혈장세포 수지상세포(pDC) 라인에서 내인성 IRF5 활성화를 검출하는 강력한 분석법들을 기술한다. 이 프로토콜은 단량체 및 이량체 형태로 IRF5를 구별할 수 있는 변형된 비분진 전기 동공 분석법으로 구성되어 IRF5 활성화를 분석하는 저렴하고 민감한 접근 방식을 제공합니다.

서론

인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응 조절에 중요한 전사 조절제이며, 특히 염증성 사이토카인 및 I형 인터페론(IFN)의 방출에서 특히 두드러진 역할을합니다. ,3. IRF5의 오질은 전신 성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 등과 관련된 IRF5 궤적의 다양한 다형성에 의해 명백한 바와 같이 수많은 자가면역 질환에 기여하는 요인입니다4. 5,6,7,8,9,10. 따라서, 내인성 IRF5 활성화 상태에 대한 강력한 검출 분석은 생리학적으로 관련된 세포 맥락에서 IRF5의 조절 경로 및 다운스트림 효과를 이해하는 데 매우 중요하다.

IRF5는 단핵구, 수지상 세포(DC), B 세포 및 대식세포1,11로구성적으로 발현된다. 다른 IRF 가족 전사 요인과 마찬가지로, IRF5는 잠복 상태에서 세포질에 상주합니다. 활성화 시, IRF5는 인산화되고 호모머를 형성하며, 핵으로 옮기고 I IFN 유형과 염증성 사이토카인을 코딩하는 유전자의 특정 조절 요소에 결합하여 결국 이러한 유전자의 발현을유도합니다 1 ,2,11,12,13. IRF5는 Endosomes에 국한되어 있는 TLR7, TLR 8 및 TLR 9와 같은 다양한 톨-유사 수용체(TLR)의 선천적 면역 반응을 조절하고신호 1,11,14에MyD88을 사용한다. 이러한 TLRs는 주로 감염15,16,17,18의증상인 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 미수정 CpG DNA와 같은 외래 핵산 종을 인식한다. IRF5는 세균, 바이러스성 및 곰팡이 감염에 대하여 면역 반응을 조절하기 위하여 보였습니다19,20,21. 면역 계통에 있는 IRF5의 영향력 있고 다양한 역할을 고려하면, IRF5 활동을 강화하거나 감쇠하는 것은 치료제22의발달을 위한 새로운 도로역할을 할 수 있었다. 따라서, 다른 세포 유형에서 IRF5 활성을 조절하는 경로 및 메커니즘에 대한 철저한 조사를 허용하기 위해 내인성 IRF5의 활성화 상태를 모니터링하는 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.

우리의 지식의 베스트에, 내인성 IRF5 활성화를 위한 생화확적인 또는 젤 전기 동체 분석제는 이 프로토콜의 발달 의 앞에 간행되었습니다. 인산화는 IRF5 활성화의 중요한 첫 번째 단계인 것으로 나타났으며, 인광특이적 IRF5 항체는 IRF5 활성13에중요한 세린 잔기의 발견 및 확인을 이끌어 낸 것으로 개발되었다. 그러나, 항체가 면역침전 또는 과발현23때인산화된 IRF5를 명확하게 검출하는 동안, 우리 손에서 전체 세포 에서 IRF5 인산화를 검출하지 못한다(데이터는 도시되지 않음). 이분화는 IRF5 활성화의 다음 단계이며, 이 단계를 조사하는 많은 중요한 연구는 일반적으로 IRF511,12를 표현하지 않는 관련이없는 세포 유형에서 종종 에피토프 태그가 달린 IRF5의 과발현에 의존했습니다. ,24,25. 이전 연구는 이분화 된 IRF5가 항상 핵으로 전이되지 않을 수 있으므로 반드시 완전히 활성화되지는 않는 것으로 나타났습니다25,26. 내인성 IRF5 핵 국소화를 위한 분석실험은 영상유세포분석(27)에의한 IRF5 활성화를 평가하기 위해 개발되었다. 이 분석은 IRF5 활성을 이해하는 데 결정적인 연구에서 적용되었으며, 특히 1차 또는 희귀 세포 유형28,29에서 이 분야의 지식을 크게 발전시켰습니다. 그러나, 이 분석은 연구원에게 널리 유효하지 않은 전문화한 계기에 의존합니다. 또한 IRF5 규제 경로를 해부하고 업스트림 레귤레이터 및 경로 구성 요소를 식별하는 동안 초기 활성화 단계를 조사해야 하는 경우가 많습니다. 이 연구는 분자 생물학 도구가 장착 된 실험실에서 수행 할 수있는 IRF5의 초기 활성화 이벤트에 대한 강력하고 신뢰할 수있는 생화학 분석을 제공합니다. 여기서 설명된 프로토콜은 IRF5 핵 국소화23의 이미징 흐름 세포 측정 분석과 같은 직교 분석과 결합될 때 특히 IRF5 작용의 경로 및 메커니즘을 조사하는 데 매우 유용할 것입니다. 27,28,30.

네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동공 (native PAGE)은 단백질복합체(31,32)를분석하는 데 널리 사용되는 방법이다. 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)과는 달리 네이티브 PAGE는 모양, 크기 및 전하에 따라 단백질을 분리합니다. 또한 변성 없이 기본 단백질 구조를 유지31,33,34,35. 제시된 프로토콜은 네이티브 PAGE의 이러한 기능을 활용하고 IRF5의 단조및 조준체 형태를 모두 감지합니다. 이 방법은 내인성 인광IRF5를 검출할 수 있는 적합한 시판 항체가 없기 때문에 조기 활성화 이벤트를 검출하는 데 특히 중요합니다. 이전에는 네이티브 PAGE를 사용하여 IRF5 이분화를 평가하는 여러 연구가 발표되었습니다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 활성화 상태를 분석하기 위해 외인성 에피토프 태그 IRF5의 과발현에 의존2,13,24,36, 37 . 이 작품은 인간 혈장 세포 수지상 세포 (pDC) 라인에서 수정 된 네이티브 PAGE 기술을 통해 내인성 IRF5 이량 분석을 분석하기위한 단계별 프로토콜을 제시하며, 여기서 IRF5 활성은 그 기능에 중요한 것으로 나타났습니다1, 38,39,40. 이 와 같은 기술은 다른세포주(23)에적용되었다.

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프로토콜

참고: 여기서 설명된 프로토콜은 TLR7/8의 작용제인 resiquimod(R848)로 처리된 CAL-1 pDC 세포주를 사용합니다. 본 프로토콜은 RAW 264.7(뮤린 대식세포선), THP-1(인간 단핵세포주), BJAB(인간 B 세포주), 라모스(인간 B 세포주), 및 MUTZ-3(인간 수지상세포주)를포함하는 다른 인간 및 뮤린 세포유형에 적용되었다.

1. CAL-1 세포의 자극

  1. 37°C에서 T75 플라스크에서 CAL-1 세포 배양물을 37°C및 5%CO2의 멸균 조건에서 RPMI 1640 배지의 5% 태아 소 혈청(FBS), 25 mM HEPES 및 1x 메르카프토에탄올(즉, 완전한 RPMI 1640 배지)을 함유합니다.
  2. 세포를 50 mL 원엽 튜브로 옮김.
    참고: CAL-1 세포는 부착되지 않습니다. 부착 세포 유형의 경우, 표준 트립시니화는 세포를 수확하기 위해 수행 될 수있다.
  3. 실온(RT)에서 5분 동안 200 x g의 세포를 원심분리합니다. 상온액을 제거하고 완전한 RPMI 1640 배지의 8 mL에서 세포 펠릿을 재중단하여 균일한 단일 세포 현탁액을 얻었다.
  4. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 1 x 10의 밀도로 6 개의 웰 플레이트에서 잘 4 mL의 예열 된 완전한 RPMI 1640 배지를 각각 잘 시드합니다. 37°C에서 20-24시간 동안 배양하고 5%CO2를 배양하여 동급이 90%-95%에 도달할 수 있도록 합니다(약 1.5 x 106 세포에 해당).
  5. 6 웰 플레이트당 1 mg/mL R848의 4 μL을 추가하여 세포를 자극합니다(최종 농도 1 μg/mL). 또한 R848 처리없이 세포와 잘 자극되지 않은 제어를 설정합니다.
  6. 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 R848이 고르게 분산되었는지 확인합니다. 이어서, 37°C 및 5%CO2에서인큐베이터에서 2-16시간 동안 세포를 배양한다.

2. 세포 단백질추출

  1. 6 웰 플레이트에서 5 mL 원심 분리튜브로 셀 현탁액을 옮김을 옮김.
  2. RT에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리기를 제거하고 인산완충식염수(PBS)의 1 mL에서 세포 펠릿을 재혼하여 균일한 단세포 현탁액을 얻었다.
  3. 세포 현탁액을 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮김.
  4. 4°C에서 0.5-1분 동안 12,000 x g에서 짧게 스핀다운하고 상급체를 조심스럽게 제거합니다.
  5. 용해 완충액을 1M Tris-HCl pH 7.4(최종 농도 25mMM), 7.5 mL(최종 농도 150mMM), 0.5 mL(최종 농도 1mMM), NP-40 2.5 mL(최종 농도 1%)을 준비합니다. 글리세롤 7.5 mL (최종 농도 5%) 250 mL의 탈이온수 (ddH2O). 100x 프로테아제 억제제 일회용 칵테일을 사용 직전에 용해 완충액에 1x의 최종 농도에 추가합니다. 준비된 라시스 버퍼를 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 프로테아제 없이 용해 완충제는 4°C에서 보관될 수 있다.
  6. 30 μL의 얼음 차가운 용염 완충제에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.
  7. 얼음에 15-20 분 동안 인큐베이션합니다.
  8. 4 °C에서 15-20 분 동안 12,000 x g에서 원심 분리하여 용해를 명확히하십시오. 상급체를 새로운 프리칠된 1.5 mL 원심분리관으로 옮니다. 추출물을 항상 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 세포 용해액은 -20°C 또는 -80°C에서 보관될 수 있다. 샘플을 끓이지 마십시오.
  9. 브래드포드 시약을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.

3. 네이티브 페이지별 IRF5 이분화 분석

  1. 상부(-) 및 하부(+) 챔버 전기 영동 완충장치를 준비한다. 상부 챔버 버퍼는 1x 네이티브 PAGE 실행 버퍼에서 0.3% 나트륨 데옥시콜레이트(NaDOC)로 구성되며, 하부 챔버는 1x 네이티브 PAGE 실행 버퍼로 구성됩니다.
    참고: 모든 새로운 실행에 대한 신선한 상부 챔버 버퍼를 준비합니다.
  2. 우물을 왜곡하지 않고 물로 3%−12% 네이티브 PAGE 젤을 완전히 헹구십시오. 젤을 미니 젤 탱크에 넣고 빗을 제거합니다. 젤을 4°C 냉장실또는 얼음에서 150V에서 30분 동안 미리 실행합니다.
    참고: 사전 실행은 젤의 실행을 방해할 수 있는 과도한 암모니아 및 황황산 이온을 제거합니다.
  3. 프리런 동안, 얼음에 보관된 세포 단백질을 4x 네이티브 샘플 버퍼와 혼합하여 로딩을 위한 샘플을 준비한다.
  4. 프리런 후, 시료당 최종 부피가 10-15 μl인 단백질 10-15 μg를 적재하십시오.
    참고: 단백질의 과부하는 얼룩을 일으킬 수 있습니다.
  5. 85V에서 30분 간, 2시간 동안 150V로 젤을 실행합니다.
    참고: 다른 실험실에서 사용하는 장비와 세포주간의 차이를 고려할 때, 단백질 샘플의 농도, 전압 및 실행 시간을 약간 수정하여 이 프로토콜을 최적화하는 것이 적절할 수 있습니다. 실행 시간을 늘리면서 사전 실행 및 실행 전압을 낮추면 이량 분해 능분과 결과 일관성을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  6. RT에서 30 분 동안 SDS 러닝 버퍼 (25 mM Tris pH 8.3, 250 mM 글리신, 0.1 % SDS)에 젤을 담그십시오.
    참고: 교반이 필요하지 않습니다. 때때로, 밴드의 세기는 주로 IRF5의 단모체 형태에 영향을 미치는 deoxycholate (DOC)의 존재로 인해 비효율적인 전달로 인해 로드된 단백질의 양에 비례하지 않을 수 있다. 전송 전에 SDS 실행 버퍼에 젤을 적시면 이 문제가 해결됩니다. 젤은 깨지기 쉽습니다. 젤의 바닥 (즉, 더 높은 백분율)에서 극단적 인주의를 기울여 처리하십시오.

4. IRF5의 면역 블롯 분석

  1. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PDVF) 멤브레인을 메탄올에 약 5분 간 담가 활성화합니다.
  2. 멤브레인의 한 쪽 모서리에 잘라서 방향을 나타냅니다. 제조업체의 프로토콜에 자세히 설명된 순차적 순서에 따라 전송 샌드위치를 조립하여 기포가 끼어있지 않도록 각별한 주의를 기울입니다.
  3. 전해 카세트를 탱크에 넣고 얼음에 1 시간 동안 20V로 옮김하십시오.
    참고: 모든 배양을 수행하고 흔들 쉐이커와 후속 단계에서 세안.
  4. 이송이 완료된 후 플라스틱 집게로 카세트에서 멤브레인을 제거합니다. RT에서 45분 동안 차단 버퍼(TBS)에서 멤브레인을 차단합니다.
    참고: 5% BSA가 있는 TBS 버퍼도 블로킹 버퍼로 사용할 수 있습니다.
  5. 표 1에열거된 원발성 항체로 멤브레인을 배양한다. 1x TBST 세척 버퍼 (20 mM Tris, pH 7.0, 150 mM NaCl 및 0.1 % 트위넨 20)로 멤브레인을 흔들면서 3 분 동안 씻으하십시오. 세탁을 2x 반복합니다.
딜루션 (동음이의)딜루션 버퍼외피코멘트
1 차 항체 (항 IRF5)1/1,000TBS 블로킹 버퍼RT에서 4 °C 또는 2 시간에서 하룻밤희석된 항체는 0.02% 아지드 나트륨이 있는 상태에서 4°C에서 보관하는 경우 여러 번 재사용할 수 있다.
이차 항체 (항 토끼)1/10,000TBS 블로킹 버퍼RT에서 45분희석된 항체는 0.02% 아지드 나트륨이 있는 상태에서 4°C에서 보관하는 경우 여러 번 재사용할 수 있다.
참고: 희석은 제조업체마다 다르므로 최적화되어야 합니다.

표 1: 면역블롯팅 절차에 사용되는 항체의 사양.

  1. 표 1에열거된 이차 항체로 멤브레인을 배양합니다. 1x TBST 세척 버퍼에서 멤브레인을 3 분 동안 씻으소서. 세탁을 2x 반복합니다.
  2. 적절한 젤 문서 시스템을 사용하여 얼룩을 스캔합니다.

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결과

항-IRF5 항체를 가진 면역블롯(IB)을 2시간 동안 1 μg/mL R848로 자극하거나 자극하지 않은 CAL-1 세포상에서 수행하였다(도1). 세포 리세이츠를 제조하였고, 네이티브 PAGE를 수행하였다. 자극되지 않은 CAL-1 세포에서, IRF5는 네이티브 PAGE상에서 단일 대역으로서 검출되었고, 그 단일체형 형태에 상응하였다. 2 시간 동안 R848로 CAL-1 세포를 치료하면 IRF5 단량체의 수준은 IRF5의 디메라 형태에 상응하는 천천히 이동하는 밴드의 축적의 동시 증가와 함께 감소하였다.

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그림 1: TLR7/8 작용제로 자극했을 때 CAL-1 세포에서 내인성 IRF5이 이량화되었다.

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토론

여기서 설명된 프로토콜은 내인성 IRF5의 단일및 다이메라체 형태를 모두 구별하는 수정된 네이티브 PAGE이다. 전문 적인 화상 진찰 교류 세포분석 기술23,27,28,30를사용하여 내인성 IRF5 활성화의 검출을 보고하는 몇몇 연구 결과가 있었습니다. 이 프로토콜은 일반적인 기술과 일반적인 시약 및 도구를 사용하여 활성화의 초기 이벤트 동안 내인성 IRF5 활성화 상태를 평가합니다. 이 프로토콜은 IRF5의 단일체체 형태와 디메릭 형태를 구분할 수 있도록 표준 네이티브 PAGE 프로토콜을 간단하게 수정해야 합니다. 다른세포주(23)를이용한 연구에 쉽게 적응할 수 있다. 이러한 변형된 네이티브 PAGE 프로토콜은 비특이적 단백질 간섭 없이 두 가지 형태로 내인...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 크라우처 재단과 시티 대학교 스타트업 기금의 기금으로 지원되었습니다. 우리는 실험과 원고의 비판적 독서에 도움을 차우 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올Life Technologies, HK21985023
300 W/250 V 전원 공급 장치 230 V ACLife Technologies, HKPS0301
Anti-IRF5 항체Bethyl Laboratories, USAA303-385
BIOSAN Rocker Shaker (Cold Room Safe)EcoLife, HKMR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mLLife Technologies
글리세롤 500 mLLife Technologies15514011
GlycineLife Technologies, HK15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated AntibodyLAB-A-PORTER/Rockland, HK610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated AntibodyLAB-A-PORTER/Rockland, HK611-145-002-0.5
Halt 프로테아제 억제제 칵테일 (100x)Thermo Fisher Scientific, HK78430
HEPESLife Technologies, HK15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)Gene Company, HK927-50000
Mini Tank blot module combo; 전송 모듈, 액세서리Life Technologies, HKNW2000
NativePAGE 3-12% 겔, 10웰 키트Life Technologies, HKBN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20xLife Technologies, HKBN2001
NativePAGE Sample Buffer 4xLife Technologies, HKBN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene GlycolTin Hang/ Calbiochem, HK#492016-100ML
PBS 7.4Life Technologies, HK10010023
폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인Bio-gene/Merck Millipore, HKIPFL00010
단백질 분석 키트 II(BSA)Bio-Rad, HK5000002
R848Invivogen, HKtlrl-r848
RPMI 1640Life Technologies, HK
염화나트륨ThermoFisherBP358-1
나트륨 데옥시콜레이트 ≥ 97% (적정)Tin Hang/Sigma, HKD6750-100G
TrisLife Technologies, HK15504020
TWEEN 20Tin Hang/Sigma, HK#P9416-100ML
1557502061870127

참고문헌

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