여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.
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방법 논문
투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구
이 논문에서
요약
초록
종양 유래 paracrine 신호는 국부적인 면역 억제의 간과된 분대이고 지속적인 암 성장 및 전이를 위한 관대한 환경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라크린 신호는 T 세포의 표면에 PD-1과 직접 상호 작용하는 종양의 표면에 발현된 PD-L1과 같은 상이한 세포 유형 간의 세포 접촉, 또는 면역 세포에 영향을 미치는 종양 세포에 의한 리간드의 분비를 포함할 수 있다. 여기서 우리는 면역 세포(대식세포) 활성화에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 심문하는 공동 배양 방법을 설명한다. 이 간단한 절차는 시판된 0.4 μm 폴리 카보네이트 멤브레인 투과성 지지대 및 표준 조직 배양 판을 이용합니다. 기재된 과정에서, 대식세포는 하부 챔버 내의 상부 챔버 및 종양 세포에서 배양된다. 0.4 μm 장벽의 존재는 두 세포 유형이 파라크린 리간드에 동일한 배지 및 노출을 공유하기 때문에 물리적 접촉의 혼란스러운 변수없이 세포 간 신호의 연구를 허용합니다. 이 접근법은 대식세포(예를 들어, 유전적 녹아웃 마우스로부터의 분리) 또는 종양(예를 들어, CRISPR 매개 변경)의 유전적 변경과 같은 다른 사람들과 결합되어 특정 분비 된 인자 및 수용체의 역할을 연구할 수 있다. 이 접근법은 또한 두 세포 집단을 분리하기 위한 유동 선별없이 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 표준 분자 생물학적 분석에 적합합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)은 유사하게 분비 된 리간드를 측정하여 다중 세포 유형 컨텍스트에서 세포 신호의 동적 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있다. 동시 조절 된 사건의 연구를 위해 공동 배양 기간은 또한 다양 할 수 있습니다. 이 공동 배양 방법은 면역 문맥에서 종양 분비 된 신호의 연구를 용이하게하는 강력한 도구입니다.
서론
최근 연구는 면역 세포에 의한 검출을 피하고, 국소 면역 활성화를 억제하거나, 종양 미세 환경에서 내성 종양 허용 밀리를 생산하는 암세포의 능력에 초점을 맞추고 있다. 종양과 면역 세포 상호 작용의 2개의 넓은 종류는 이 효력을 촉진하는 기술되었습니다: 접촉 중재한 상호 작용 또는 종양 분비 한 리간드. 종양에 의해 이용되는 접촉 매개 면역 억제의 가장 잘 연구되고 임상적으로 견인가능한 메커니즘 중 하나는 그들의 활성화 및 기능을 억제하기 위해 T 세포에 PD-1과 상호 작용하는 PD-L1의 발현이다1,2. 다수의 활성화된 면역 세포에 의해 발현되는 인터페론 감마(IFNγ)에 반응하여, 종양 세포는 PD-L1의 발현을 증가시켜 활성 T 세포를 발현하여, 이를 효과적으로 종양 세포를 근절하지 못하게 한다3. PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 차단하는 항체의 사용은 현재 인간4에서여러 암 유형을 치료하는 데 사용된다. 이러한 임상적 성공 및 기타에 비추어, 종양 유래 면역억제 메커니즘의 식별 및 표적화는 점점 더 주목을 받고 있다.
적응 면역의 억제를....
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프로토콜
유린 복막 대식세포의 수확 및 사용과 관련된 모든 절차는 채플 힐 (UNC)의 노스 캐롤라이나 대학에서 실시되었으며 UNC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 대식세포 문화
참고: 이 절차는 1 차적인 맥기 대식세포 (아래에 자세히 설명함), 골수 유래 대식세포, 또는 J774 (ATCC) 또는 RAW264 (ATCC)와 같은 대식세포 세포주를 이용할 수 있습니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 배차 후막대식세포(16,17 및 플레이트는 0.4 μm 폴리에스테르 막 삽입의 상부 챔버(들)로 직접 플레이트-배양 6웰 플레이트(도1A).
참고 : 각 격리에서 대식세포의 대략적인 수율은 총 1 x 106 셀이므로 웰 당 평균 세포 수는 6 개의 웰 플레이트에서 ~ 1.5 - 1.6 x 105 셀입니다. - 37°C에서 3일간 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)/F12, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 20....
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결과
대식세포 편광에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 확인하기 위해, 기재된 절차를 활용하였습니다. 종양 세포의 부재에서 배양된 맥막 대식세포는 음성(치료되지 않은 = 멀리 왼쪽) 및 양성(IFNγ 및 LPS 자극 = 왼쪽으로부터2nd) 대조군(도2A)으로사용하였다. 대안적으로, 맥막 대식세포는 B16F10 흑색종 종양 세포(ATCC)와 공동 배양하였다(도1A). 도금 직후, 세포는 IFNγ 및 LPS로 처리하거나 치료되지 않은 상태로 방치하였다. 배양 24시간 후, 대식세포를 수확하고, RNA를 제조하고, qRT-PCR을 수행하여 염증성 유전자의 발현을 측정하였다. 여기에 기재된 공동 배양 시스템을 사용하여, 우리는 B16F10 종양 세포의 존재에서 공동 배양된 맥막 대식세포가 활성화되지 않았지만 자극(LPS + IFNγ)을 활성화시키지 않고, 염증성-관련 유전자의 발현을 증가시키지 않았다는 것을
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토론
여기에서 제시된 공동 문화 분석법은 면역 세포 활성화에 종양 분비 요인의 연구를 허용하는 이전에 확립된 분석법의 수정입니다. 세포-세포 접촉은 면역 활동에 있는 변경을 유도하기 위하여 알려지는 동안, 면역 성 활성화를 조절하는 종양 분비 리간드의 기능은 잘 이해되지 않습니다. 우리는 직접적인 공동 배양과는 달리, 종양 유래 분비 요인이 접촉 매개 신호의 혼란스러운 특성 없이 면역 세포 활성화에 미치는 영향을 심문하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명합니다. 면역 억제에 있는 종양 분비 된 리간드의 잠재적인 임상 중요성을 감안할 때, 이 방법은 직접적인 공동 문화에 의해 해결되지 않는 방법으로 이 기계장치를 공부하기 위하여 이용하기 쉬운 공구를 제안합니다.
본질적으로, 여기서 기술된 공동 배양 방법은 물리적 접촉 없이 종양 세포(세포주 또는 1차 세포)와 대식세포(1차 세포: 상주, 골수 유래 또는 대식세포 세포주)의 배양을 포함한다. 대식세포는 0.4 μm 크기의 폴리에스테르 멤브.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
에릭 우빌은 부분적으로 미국 암 학회 박사 후 펠로우십 (128770-PF-15-216-01-LIB)에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 NIH(R01-CA205398)의 보조금과 유방암 연구 재단 상(BCRF-18-041)에서 HSE에 수여되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA 합성 키트 | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 배지 | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| 소 태아 혈청 | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| 대장균 O111:B4의 지질다당류 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| 재조합 마우스 IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX 키트 | Bioline | QT625-05 | |
| 트랜스웰 투과성 서포트 | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
참고문헌
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al.
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재인쇄 및 허가
