손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.
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방법 논문
유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석
이 논문에서
요약
초록
뉴런은 그들의 기능을 지원 하기 위해 높은 에너지에 대 한 강렬한 요구. 축 세포를 따라 손상 된 미토 콘 드리 아 수송 인간의 신경에서 관찰 되었습니다., 다양 한 질병 상태에서 신경 변성에 기여할 수 있는. 살아있는 인간 신경에 있는 미토콘드리아 역학을 검토하는 것은 도전적이더라도, 그 같은 패러다임은 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 공부하기 를 위해 중요합니다. 여기서 기재된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 유래된 전뇌 뉴런 축에서 미토콘드리아 수송 및 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 프로토콜이다. iPSCs는 잘 확립된 방법을 사용하여 텔렌세팔산 글루탐생성 뉴런으로 분화됩니다. 뉴런의 미토콘드리아는 미토트래커 CMXRos로 염색되고, 축색내미토콘드리아 운동은 세포 배양을 위한 인큐베이터가 장착된 살아있는 세포 이미징 현미경을 사용하여 포획된다. 시간 경과 이미지는 "MultiKymograph", "바이오 포맷 수입기", "매크로"플러그인소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 미토콘드리아 수송의 척추 그래프가 생성되고, 전위 및 역행 방향의 평균 미토콘드리아 속도가 kymograph에서 읽습니다. 미토콘드리아 형태 분석에 관해서는, 미토콘드리아 길이, 면적 및 종횡비는 ImageJ를 사용하여 얻어진다. 요약하면,이 프로토콜은 축삭을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화및 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하기 위해 자신의 형태학의 분석을 할 수 있습니다.
서론
미토콘드리아 운동성 및 분포는 편광 뉴런의 가변적이고 전문적인 에너지 요구를 충족시키는 데 중요한 역할을 합니다. 뉴런은 Ca2+ 버퍼링 및 이온 전류에 대한 높은 수준의 에너지를 요구하는 시냅스의 형성을 통해 표적과 연결하기 위해 매우 긴 축세포를 확장할 수 있습니다. 소마에서 축종으로미토콘드리아를 운반하는 것은 뉴런의 축축및 시냅스 기능을 지원하는 데 매우 중요합니다. 공간적 및 시간적으로 동적 미토콘드리아 운동은 초당 수 마이크로미터의 속도로 빠른 축색 수송에 의해 수행됩니다1.
구체적으로, 운동 또는 어댑터 단백질, 예컨대 키네신 및 다인, 미토콘드리아2,3의움직임을 조절하기 위해 마이크로소튜플을 따라 빠른 소기관 수송에 참여한다. 정상적인 신경 활동은 뉴런 소마에서 말단 축종 (전방 축색 수송)으로 새로 조립 된 미토콘드리아의 적절한 수송을 필요로하고 원위 축사에서 다시 세포체로 미토콘드리아의 역수송 (역행 수송). 최근 연구에 따르면 부적절한 미토콘드리아 할당은 신경 성 결함 및 운동 신경 퇴행성 질환4,....
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프로토콜
1. iPSCs에서 텔렌세팔성 글루타마티터지뉴런 생성
참고: iPSCs를 유지하기 위한 상세한 프로토콜과 텔렌세팔산 글루탐매터기뉴런으로의 분화는 앞서설명한 18과유사하다. 여기서, 인간 다능성 줄기 세포의 분화 동안 중요한 과정이 도입되고 강조된다.
- 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더에 대한 배양 iPSCs는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 배지에서 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 4 ng/mL)로 보충하였다.
- 디스파스 (1 mg / mL)로 배양 한 후 3 분 동안 iPSCs를 작은 덩어리로 해리하십시오. 이어서, 4일 동안 hESC 배지에서 iPSC 응집체를 현탁액으로 배양한다. iPSC가 서스펜션 문화로 시작되는 경우 1일차(D1)를 참조하십시오. 매일 4일 동안 매체를 변경합니다.
- D5에서, 원심분리 후 iPSC 응집체를 200 x g에서 2분 동안 수집하고 3일 동안 신경 유도 배지(NIM)에서 배양한다. 세포 응집체를 3일 동안 현탁액으로 배양하여 배지의 절반을 2일마다 변경한다. 신경 유도 효율을 높이기 위해 NIM 배지에 DMH-1(2 μM) 및 SB431542(2 μM)를 추가합니다.
- D8에서 원....
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결과
여기서, 인간 iPSCs는 텔렌세팔산 글루타마티터지뉴런으로 분화되었고, 이는 Tbr1 및 βIII 튜불린 마커로 면역염색을 특징으로하였다(도 1A). 미토콘드리아의 축색 수송을 검사하기 위해, 이들 세포는 적색 형광 염료로 염색되었고, 시간 경과 이미징을 수행하였다. ImageJ는 쉽게 사용할 수 있고 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 미토콘드리아 수송은 그림 1에도시된 "MultiKymograph" 및 "매크로" ImageJ 플러그인으로 추가로 분석되었다.
정적, 전방 및 역행 운동을 포함하여 미토콘드리아 운동의 3개의 각각 상태가 있습니다(그림 1B,C). 단일 미토콘드리온은 축색 내의 전방 또는 역행 방향으로 정적 또는 이동을 유지할 수 있으며, 여기서, 미토콘.......
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토론
이 기사에서는 적색 형광 염료 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 뉴런 축색의 미토콘드리아 수송 및 형태를 분석하는 방법을 설명하며, 둘 다 신경 퇴행성 질환에서 축사 변성 및 미토콘드리아 형태를 연구하는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 프로토콜에는 미토콘드리아의 염색, 살아있는 세포 화상 진찰 및 심상 분석을 포함하여 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 이 방법에서는, 형광 염료를 미토콘드리아를 염색하는데 사용되었다. 인간의 iPSC 유래 뉴런은 접시에서 쉽게 분리되기 때문에 접시에 몇 가지 용액을 남기고 신경 기저 배지를 부드럽게 추가하는 것이 중요합니다. 세척은 염료를 제거하기 위해 서너 번 수행 될 수있다. 또한, 미토콘드리아는 다른 기자들과 함께 표지되어 형광 단백질과 같은 축슨을 따라 그들의 수송을 측정할 수 있으며, 미토콘드리아 표적화 단백질6. 장기 추적에서, 여러 프로브(즉, NPA-TPP, 2,1,3-벤조티아디아졸[BTD] 형광 유도체 및 특정 라만 프로브)는 장기 미토콘드리.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 경련 하반신 마비 재단, 블레이저 재단과 NIH (R21NS109837)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase 세포 분리 솔루션 | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 생물안전 후드 | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| F12 영양 혼합물이 있는 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| 섬유 아세포 성장 인자 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free 감소 성장 인자 기저막 매트릭스 | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex 무혈청 보충제 | Gemini | 400-160 | |
| 유리 바닥 접시 | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' 유리 피펫 | VWR | 14673-043 | |
| 신경교세포 유래 신경영양인자(BDNF) | 시그마-알드리치 | D0627 | |
| 글루타MAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| 헤파린 | 시그마 | H3149 | |
| 인슐린 성장 인자 1 (IGF1)인비트 | 로젠 | M7512 | |
| 녹아웃 세럼 대체제 | Gibco | A31815 | |
| 라미닌 | 시그마 | L-6274 | |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마 | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| 비필수 아미노산 | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle 무혈청 보충 | : Gemini | 400-163 | |
| 올림푸스 현미경, IX83 | 올림푸스 | IX83-ZDC2 | |
| PBS | 코닝 | 21-031-CV | |
| 위상차 현미경 | 올림푸스 | CKX41 / IX2-SLP, | |
| 6 웰 플레이트 | 코닝 | 353046 | |
| 24 웰 플레이트 | 코닝 | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| 멸균 50ml 일회용 진공 여과 시스템 0.22 μ m 밀리포어 익스프레스® 플러스 멤브레인 | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μ M PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 항체 (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| 트립신 억제제 | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml 튜브 | Phoenix | SS-PH50R | |
| 15 ml 튜브 | Phoenix | SS-PH15R | |
| T25 플라스크 (미처리) | VWR | 10861-572 | |
| 소프트웨어용 플러그인 | |||
| Bio-formats 패키지 | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| 피지 소프트웨어 | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph 플러그인 | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
참고문헌
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along micro....
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재인쇄 및 허가
