써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

요약

여기에서 우리는 96 웰 플레이트 포맷에서 몰리브덴 청색 반응에 기초한 막 결합 된 열광파타제 (Thermotoga maritima에서)억제제에 대한 스크리닝 방법을 제시한다.

초록

막 결합 된 열광파타제 (mPPases)는 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충에서 발생하는 디메라 효소입니다. 이 단백질은 양성자 및 /또는 나트륨 이온이 막을 가로 질러 펌핑과 결합된 두 개의 정형 외과 인산염 분자로 파이로 포스페이트를 갈라. 동물과 인간에서 상동성 단백질이 발생하지 않았기 때문에 mPPases는 잠재적인 약물 표적의 설계에 좋은 후보입니다. 여기서 우리는 96 웰 플레이트 시스템에서 몰리브덴 청색 반응을 활용하는 mPPase 억제제에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 모델 효소로 열성 박테리아 써모토가 마리티마 (TmPPase)에서 mPPase를 사용합니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하여 일관되고 강력한 결과를 생성합니다. 분석의 시작부터 흡광도 측정까지 활성 분석 프로토콜을 완료하는 데 약 1시간 밖에 걸리지 않습니다. 이 분석에서 생성된 청색은 오랜 기간 동안 안정되기 때문에, 후속 분석은 이전 배치 직후에 수행될 수 있으며, 흡광도는 나중에 모든 배치에 대해 한 번에 측정될 수 있다. 이 프로토콜의 단점은 수동으로 수행되므로 파이펫팅 및 시간 유지의 좋은 기술을 필요로 할뿐만 아니라 소진 될 수 있다는 것입니다. 또한,이 분석법에 사용되는 비소 - 구연산염 용액은 독성이 있으며 필요한 예방 조치로 처리되어야하는 나트륨 비소염을 포함합니다.

서론

총 세포 단백질의 약 25%는 막 단백질이고 그 중 약 60%는 약물 표적^{1,2입니다.} 잠재적인 약물 표적 중 하나인^3,막 결합 된 열광파타스 (mPPases)는 양성자 및 / 또는 나트륨 이온을 두 개의 정형 외과 인산염으로 열분해하여 막을 가로 질러 펌핑하는^{효소입니다 4.} mPPases는 인간과^동물을제외하고 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충과 같은 다양한 유기체^5에서 발견될 수 있습니다 4. 프로티스트 기생충에서, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸, 톡소플라즈마 곤디, 트리파노소마 브루시,mPPases는 기생충 에서 이러한 발현의 결손증⁶ 및 녹아웃에 필수적이며 외부 기본^pH7에노출시 세포내 pH를 유지하는 데 실패로 이어진다. 척추동물에 존재하는 상동 단백질의 중요성과 부족으로 인해 mPPases는 프로티스탈 질환에 대한 잠재적 인 약물 표적으로 간주 될 수 있습니다

프로토콜

1. 단백질 준비

참고: TmPPase의 발현 및 정제는 다른^{곳에서 13에}기술되었습니다.

1. 20 mM-(N-morpholino)에탄에설포닉산(MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) 글리세롤, 2 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.05% 도데실 말토사이드(DDM)를 함유하는 재활성화 완충액의 10 mL을 준비한다.
2. 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl_2,333 mM KCl 및 67 mM NaCl을 포함하는 반응 혼합물의 10 mL을 준비한다.
   참고: Mg^2+는 mPPase의 기질로서 파이로포스페이트에 chelate하는 데 필요하며,^K+는 TmPPase가 칼륨 의존성 mPPase로서 효소 활성을 증가시키는 데 필요하며,^Na+는 TmPPase에 의한 나트륨 이온 전좌 동안효소 활성에 필요하다.
3. 효소 재활성화를 위해 30 mg/mL 리포솜을 준비하십시오.
   1. 10 mL의 20 mM 트리스-HCl pH 8.0을 1 mMDTT와 1 mM DTT를 추가하여 1mMM DTT를 사용하여 20 mM Tris-HCl pH 8.0의....

결과

본 프로토콜에서, 8개의 화합물(1−8)을 양성 대조군으로서 열포염의 일반적인 억제제인 IDP와 함께 시험하였다(도2A). 각 화합물은 삼중항에서 3개의 상이한 농도(1 μM, 5 μM 및 20 μM)에서 시험하였다. 스크리닝의 워크플로우는 샘플 및 시약 준비부터 860 nm의 흡광도 측정까지 의 도 1에도시되어 있습니다.

이 프로토콜의 끝에서, 용액 A + B 및 비소성 구연산염의 첨가 후, 용액은 관찰 될 수있는 몰리브데이트와 인산이온의 복잡한 형성으로 인해 709 nm 및 860 nm^14에서 최대 흡수와 안정적인 푸른 색을 개발하고 효소 반응의 발생을 보여줍니다. 본 실험을 위해, 우리는 709 nm^15에서흡광도에 비해 검출 한계 및 감도가 더 우수하기 때문에 방출된 P_i

토론

여기에서 우리는 Vidilaseris 등^14에근거를 둔 96 개의 웰 플레이트 포맷에서 T. maritima에서 막 결합 된 열성 포에 대한 억제제의 간단한 스크리닝을위한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 프로토콜은 저렴하고 산성 조건하에서 정형 외과 및 몰리브데이트에서 형성되고 뚜렷한 청색^12를가진 인산염 종으로 감소되는 12-포스포모모리브딕 산을 기반으로 합니다. 이 방법은 보다 민감한 말라카이트 녹색^{분석법(16)과}같은 다른 프로토콜보다 선호되며, 이 방법은 TmPPase^{재활성화에}필요한 높은 인지질 농도의 존재에 간섭을 나타내지 않기 때문이다.

스크리닝 프로토콜의 워크플로우는 그림 1에 도시되어 있으며 이 프로세스는 1시간 안에 완전히 완료.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
접착 밀봉 시트	Thermo Scientific	AB0558
암모늄 헵타몰리브덴데이트 테트라하이드레이트	Merck	F1412481 636
아스코르브산	Sigma-Aldrich,	95212-250G
, BioLite, 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR 튜브 스트립 0.2ml, 캡 없음 (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
에탄올	Merck	1009901001
빙초산	Merck	1000631011
염산	Sigma-Aldrich	258148-500ML
이미도디포스페이트 나트륨 소금	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
염화마그네슘	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
폴리스티렌 페트리 접시 (크기 150mm x 15mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
염화칼	Merck	104936
Prism 6 소프트웨어	GraphPad
QBT2 가열 블록	그랜트 기기
나트륨 메타 비소	Fisher Chemical
인산나트륨 이염기성 (Pi)	시그마	S0876-1KG
피로 인산 나트륨 이염 기성	플루카	71501-100G
구연산 삼 나트륨 이수화물	플루카	71404-1KG

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