초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Elaine  M. Mihelc; Stephanie Angel; Robert  V. Stahelin; Seema Mattoo

doi:10.3791/60677

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방법 논문

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

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DOI:

10.3791/60677

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2020년 2월 27일

Elaine M. Mihelc¹ , Stephanie Angel² , Robert V. Stahelin²^,³^,⁴ , Seema Mattoo¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Biological Sciences, Purdue University, ²Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, ³Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, ⁴Bindley Biosciences Center, Purdue University, ⁵Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, ⁶Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초록

신호 전이 및 막 인신 매매 와 같은 주요 세포 이벤트는 세포 구획 내의 적절한 단백질 위치에 의존합니다. 단백질의 정확한 세포 내 외 현지화를 이해하는 것은 많은 생물학적 질문에 대답하기 위해 이렇게 중요합니다. 적절한 세포 보존 및 염색과 결합된 단백질 국소화를 식별하기 위한 견고한 라벨에 대한 탐구는 역사적으로 어려운 일이었습니다. 전자 현미경 검사법 (EM) 화상 진찰에 있는 최근 어드밴스는 세포 보존을 증가하고 표적 단백질을 표시하기 위하여 많은 방법 그리고 전략의 발달로 이끌어 냈습니다. 비교적 새로운 퍼옥시다아제 기반 유전자 태그인 APEX2는 복제 가능한 EM 활성 태그의 유망한 리더입니다. 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)을 위한 견본 준비는 또한 고압 동결 (HPF) 및 저온 탈수 및 동결 치환 (FS)를 통해 염색에 의한 저온화의 출현과 더불어 최근에 진보했습니다. HPF 및 FS는 유리체 샘플의 저온 이미징에 이어 두 번째로 TEM 이미징을 위한 셀룰러 울트라구조의 우수한 보존을 제공합니다. 여기서 우리는 HPF 및 FS와 APEX2 태그의 사용을 결합하는 cryoAPEX 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 관심 있는 단백질은 APEX2로 태그가 지정되고 화학적 고정 및 과산화아제 반응이 뒤따릅니다. 실온에서 전통적인 염색 및 알코올 탈수 대신, 샘플은 저온이며 FS를 통해 저온에서 탈수 및 염색을 겪습니다. cryoAPEX를 사용하면 관심 있는 단백질을 세포외 구획 내에서 식별할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 보존된 멤브레인 내에서의 토폴로지와 관련하여 추가 정보를 해결할 수 있습니다. 우리는 이 방법이 세포기관 루멘 내의 단백질 분포 패턴을 해독하고, 다른 표지되지 않은 소기관과 가까운 한 소기관 내에서 단백질의 구획화를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 추가, cryoAPEX는 절차적으로 간단 하 고 조직 배양에서 성장 하는 세포에 순종. 일반적인 동결 및 동결 대체 방법보다 기술적으로 더 어렵지 않습니다. CryoAPEX는 유전적으로 태그가 지정될 수 있는 막 단백질의 TEM 분석에 널리 적용됩니다.

서론

생물학 연구는 수시로 세포와 세포기관 내의 세포내 단백질 현지화를 해결의 질문을 포함합니다. 면역형광 현미경 검사법은 단백질 국소화의 유용한 저해상도 뷰를 제공하며, 최근 초고해상도 이미징의 발전은 형광태그단백질^1,^2,^3에대한 해상도의 한계를 밀어내고 있다. 그러나, 전자 현미경 검사법 (EM)는 단백질의 표지가 도전이더라도, 고해상도 세포 초음파를 화상 진찰을 위한 금 본위제남아 있습니다.

역사적으로, 몇몇 EM 방법은 초구조 단백질 현지화의 질문에 접근하기 위하여 이용되었습니다. 가장 일반적으로 이용되는 방법 중 하나는 항원 특이적 1 차 항체가 관심있는 단백질을 검출하기 위하여 이용되는 면역전자 현미경 검사법 (IEM)입니다. EM 신호는 전자 조밀 한 입자와 공액 이차 항체의 응용프로그램에 의해 생성되며, 가장 일반적으로 콜로이드 금^4,^5. 대안적으로, 말무과후옥시다아제(HRP)와 같은 효소와 접합된항체는^{6, 7,}