이 프로토콜은 비인간 영장류 췌도에서 산소 소비의 정확하고 재현 가능한 측정을 보여줍니다. 마이크로플레이트의 아일렛 로딩 기술과 코팅은 다른 유형의 배양된 스페로이드에서 호흡을 효율적으로 측정할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전 생체 췌도와 같은 세포의 스페로이드 클러스터에서 산소 소비의 측정은 역사적으로 도전적이었습니다. 우리는 스페로이드의 산소 소비를 측정하기 위해 설계된 96 웰 마이크로 플레이트를 사용하여 아일렛 산소 소비의 측정을 보여줍니다. 이 분석에서, 스페로이드 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 및 조직 접착제로 코팅된다. 우리는 소량의 접착제 용액을 사용하여 우물의 바닥만에 대한 밑면 준수를 장려합니다. 분석 당일, 15개의 작은 섬은 최적의 섬 위치와 산소 소비의 정확한 측정을 보장하는 기술을 사용하여 각 우물의 기지에 직접 로드됩니다. 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면은 ATP 의존호흡, 최대 호흡 및 양성자 누출을 포함한 비인간 영장류 아일에서 약리학적으로 조사됩니다. 이 방법을 사용하면 웰당 소수의 섬만 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 볼 수 있습니다. 이론적으로 비슷한 크기의 배양 된 스페로이드에 적용 될 수 있습니다.
서론
정상적인 혈당 수준을 유지하기 위해 췌장 β 세포는 포도당의 고도를 감지하고 그에 따라 인슐린을 분비해야합니다. 포도 당 수준과 인슐린 분 비의 결합은 직접 포도 당 물질 대사와 미토 콘 드리 아 산화 인 산화를 통해 ATP의 생산에 연결. 따라서, 미토콘드리아는 자극 분비 커플링1에서중요한 역할을 한다. β 세포 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 손상한 인슐린 분비로 이끌어 내는 결점을 드러낼 수 있습니다. 췌장 α 세포에 의한 글루카곤의 분비는 또한 미토콘드리아 기능2와밀접하게 연관되어 있다. 불멸의 섬 세포주가 일부 유형의 분석에 유용하다는 것이 입증되었지만, 이들 세포의 생리학은 글루카곤3,4에 의한 인슐린 분비의 전위및 인슐린/소마토스타틴5,6에 의한 글루카곤 분비의 억제에 의해 예시된 바와 같이 전체 섬 기능을 정확하게 회귀하지 는 않는다. 이것은 전체, 그대로 섬을 사용하여 산소 소비를 측정할 필요성을 보여줍니다.
아일렛 세포 호흡측정기 ....
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프로토콜
1. 분석기 실행 전날 마이크로 플레이트 및 센서 카트리지 준비
섬은 앞서 설명한 대로 3 살 짜리 일본 원숭이에서 격리 되었다13. 이 방법은 시체 기증자로부터 인간의 섬을 분리하는 데 사용되는 것과 매우 유사하지만, 동물이 진정 상태에서 장기 제거 전에 췌장이 종종 콜라게나아제 용액으로 팽창되는 마우스와 다릅니다. 아일렛 검색은 오리건 국립 영장류 연구 센터 (ONPRC)와 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었으며 ONPRC IACUC의 승인을 받았습니다. ONPRC는 미국 농무부(USDA)가 시행하는 동물 복지법 및 규정과 국립보건원이 발표한 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 준수합니다.
- 스페로이드 마이크로 플레이트의 준비
- 중탄산나트륨0.1M 용액 3 mL를 준비합니다. 필터는 용액을 살균합니다. 우리는 0.45 μm 필터(재료 표)를이용했습니다.
- 세포 배양 후드에서, 0.1M 중탄산나트륨의 2.8 mL에 세포 및 조직 접착제(재료 표)의200 μL을 추가합니다. 이어서, 이 ....
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결과
작은 섬을 마이크로 플레이트에 로드하려면 그림 1A와같이 15 μL의 용지로 15 개의 섬을 흡인해야합니다. 섬은 자연스럽게 몇 초 이내에 파이펫 팁의 바닥으로 정착합니다. 그런 다음, 파이펫 팁은 웰의 바닥으로 내린다. 팁은 매우 약간 들어 올려지고 작은 부피 (약 5 μL)가 섬과 함께 파이펫아웃됩니다. 이 기술은 정확한 산소 소비 측정을 위해 마이크로 플레이트 의 바닥에 잘(그림 1B)의바닥에 아슬렛의 일관된 배치 결과.
도 2는 분석결과 전반에 걸쳐 산소 소비에 대한 개별웰에 의한 대표적인 결과를 나타낸다. 이 특정 실험은 우물의 바닥이 .......
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토론
섬 산소 소비의 연구는 이전에 작은 섬의 구형 모양에 의해 방해되었습니다, 배양 표면에 대한 준수의 부족, 그리고 잘 당 필요한 섬의 수. 이 프로토콜에서는 소수의 섬에 대한 섬 산소 소비를 측정하기 위한 96웰 스페로이드 마이크로플레이트의 효능을 강조하고 기술적으로 실현 가능하고 일관된 섬을 취급하고 적재하는 기술을 시연합니다. 결과.
작은 섬이 마이크로 플레이트의 바닥에 부착하고 분석을 통해 혼합 단계 동안 흔들리지 않도록하기 위해, 96 웰 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 접착제 용액으로 코팅된다. 이것은 일반적으로 유익하지만, 섬이 제대로로드되지 않은 경우 그들은 따라서 영향을 미치거나 정확한 측정을 배제, 오히려 바닥보다는 우물의 측면에 충실 할 책임이있다. 이에 대처하기 위해, 우리는 접착제 용액 전용 20 μL의 매우 작은 볼륨으로 우물을 코팅하는 것이 좋습니다. 또한, 우리가 보여주는 파이펫팅 기술은 섬이 우물의 바닥에 로드되고 추가 매체의 흐름에 의해 측면을 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 그들의 시설의 사용에 대한 밴더빌트 높은 처리량 스크리닝 코어를 인정하고 싶습니다, 애질런트 생명 공학, 박사 폴 Kievit (오리건 건강 과학 대학) 비 인간 영장류 고립에 대한, 에릭 Donahue (밴더빌트 대학) 그림 에 대한 도움 1. J.M.E.는 수상 번호 T32GM007347에서 건강의 국가 학회의 NIGMS에 의해 지원되었습니다. M.G.는 NIH/NIDDK(R24DK090964-06)와 재향군인회(BX003744)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 접시, 60mm X 15mm 스타일 | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak 세포 및 조직 접착제 | Corning | 354240 | |
| 원뿔형 튜브, 50mL | Falcon | 352070 | |
| 포도당 무수 | Fisher Scientific | BP350-1 | 포도당 용액, 200 mg / ml, 멸균 된 |
| 일회용 저장 탱크 (멸균), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | 멀티채널 피펫 |
| EZFlow Sterile 0.45 로딩용 μ m PES 주사기 필터, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-글루타민 | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| 멀티채널 피펫 팁 | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| 멀티채널 피펫, 15-1250 μ L | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | 권장 |
| P20, P200 및 P1000 피펫 | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH 프로브 | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| 피펫 팁, 20 μ L, 200 &뮤; L, 1000 &뮤; L | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF 기본 매체 | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF 세포 미토분 스트레스 테스트 키트 | Agilent | 103015-100 | Oligomycin, FCCP 및 Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 분석기 | 포함 Agilent | S7800B | 37 °가 있는 준비 스테이션 포함; C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 스페로이드 Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | 센서 카트리지, 스페로이드 마이크로플레이트 및 캘리브런트 포함 |
| 중탄산나트륨 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| 피루브산나트륨 | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| 실체 현미경 | Olympus | SZX9 | |
| 주사기(멸균), 5 mL | BD | 309603 | 멸균 여과용 |
| 물 (멸균) | Sigma | W3500-500mL |
참고문헌
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology
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재인쇄 및 허가
