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방법 논문

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

7.8K 조회수

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DOI:

10.3791/60723

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2020년 1월 31일

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1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Infectious Diseases, Aarhus University Hospital, 3Department of Biomedicine, Aarhus University, 4Department of Gynecology and Obstetrics, Aarhus University Hospital, 5Department of Biology, University of Nebraska at Omaha

이 논문에서

요약

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

초록

인간화된 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 바이러스학을 공부하고 항 바이러스 약물을 테스트하는 정교한 플랫폼을 제공합니다. 이 프로토콜은 성인 NOG 마우스에서 인간 면역 계통의 확립을 기술한다. 여기에서, 우리는 탯줄 혈액 유래 인간 CD34+ 세포의 격리에서 마우스로의 그들의 후속 정맥 이식, HIV 감염을 통해 모델의 조작에, 조합 antiretroviral 치료의 모든 실용적인 단계를 설명합니다 ( cART) 및 혈액 샘플링. 대략 75,000 hCD34+ 세포는 마우스로 정맥 주사되고 인간화로 알려져 있는 인간적인 키메증의 수준, 말초 혈액에서 유동 세포측정에 의해 달 동안 세로로 추정됩니다. 총 75,000 hCD34+ 세포는 말초 혈액에서 20%-50% 인간 CD45+ 세포를 산출합니다. 마우스는 HIV를 가진 질 내 감염에 영향을 받기 쉽습니다 및 혈액은 분석을 위해 매주 한 번, 그리고 연장된 기간 동안 매달 두 번 샘플링될 수 있습니다. 이 프로토콜은 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 플라즈마 바이러스 부하의 정량화를 위한 분석서를 기술한다. 우리는 마우스가 규정식에 있는 배려의 표준 cART 식이요법으로 효과적으로 취급될 수 있는 방법을 보여줍니다. 일반 마우스 차우의 형태로 cART의 전달은 실험 모델의 중요한 정제이다. 이 모형은 새로운 처리 및 HIV 치료 전략의 시험을 위해 뿐만 아니라 전신 및 국소 전노출 예방 화합물의 전임상 분석을 위해 이용될 수 있습니다.

서론

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 전 세계적으로 3,700 만 명 이상의 감염된 개인을 가진 만성감염입니다 1. 조합 항 바이러스 치료 (cART)는 생명을 구하는 치료이지만 치료법은 여전히 보증됩니다. 따라서, HIV에서 지속적인 연구를 촉진하기 위해 인간의 면역 체계와 그 반응을 반영하는 동물 모델에 대한 필요성이 있다. 세포 및 조직 생착을 지원할 수 있는 여러 종류의 인간화된 마우스는 인간 세포를 중증 면역결핍 마우스2로이식함으로써 개발되었다. 이러한 인간화 마우스는 HIV 감염에 취약하고 비인간 영장류보다 저렴하고 사용하기 쉽기 때문에 비인간 영장류 시미안 면역 결핍 바이러스 모델에 대한 중요한 대안을 제공합니다. 인간화 된 마우스는 HIV 바이러스 성 전염, 병인, 예방및 치료3,4,5,6,7,8,9,10, 11에서연구를 촉진했다.

우리는 NOD의 마우스로 코드 혈액 파생 인간 줄기 세포를 이식하여 개발 된 HIV 연구를위한 유연한 인간화 모델 시스템을 제시한다. Cg-Prkdc는Il2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) 배경을scid. 비 태아 기원의 외, 이 마우스의 실제적인 생물 공학은 혈액 간 흉선 (BLT) 구조물의 이식에 관련시킨 마이크로 외과 적 절차에 비해 기술적으로 덜 까다롭습니다.

우리는 질 내 전송을 통해 HIV 감염을 확립하는 방법과 민감한 액적 디지털 PCR (ddPCR) 기반 설정으로 플라즈마 바이러스 부하를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 매일 마우스 다이어트의 일환으로 주어진 표준 cART의 설립을 설명합니다. 이러한 결합 된 방법의 목적은 동물에 대한 스트레스를 줄이고 각 동물을 처리하는 데 소요되는 시간이 제한되어 있는 대규모 실험을 용이하게하는것입니다 12.

인간에서는, CCR5Δ32/wt 또는 CCR5Δ32/Δ32 유전자형은 송신기/창시자 바이러스13를가진 HIV 감염에 감소된 감수성을 일으키는 원인이 되고, 몇몇 예방조치는 HIV 연구 결과의 목적을 위해 줄기 세포를 가진 생명 공학 인간화한 마우스를 취할 필요가 있습니다. 이것은 CCR5 유전자, 특히 Δ32 삭제에서 자연적으로 발생하는 변이체가 스칸디나비아 및 발트 원주민 인구에서 세계14,15의나머지 부분에 비해 더 널리 퍼져 있기 때문에 우리 지역에서 특히 그렇습니다. 따라서, 당사의 프로토콜은 이식 전에 CCR5 변이체에 대한 공여자 조혈 줄기 세포를 스크리닝하기 위한 쉬운, 높은 처리량 분석방법을 포함한다.

질 내 노출을 위해 우리는 감염의 초기 단계에서 여자에게서 격리된 송신기/창시자 R5 바이러스 RHPA4259를 선택했습니다16. 우리는 마우스의 대다수에 있는 성공적인 전송을 산출하기 위하여 충분한 바이러스성 복용량에 마우스를 노출했습니다, 그러나 100% 전송 비율 의 밑에. 이러한 투여량을 선택하면 약물 후보의 항 바이러스 효과가 HIV 예방 실험에서 보호 된 동물을 초래할 수 있고 치료 연구를위한 바이러스 부하가 감소 할 수 있도록 전송 속도에서 충분한 동적 범위를 가능하게합니다.

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프로토콜

모든 코드 혈액 샘플은 부모의 익명 기부에 대한 통보 된 동의를 포함하여 현지에서 승인 된 프로토콜에 따라 엄격하게 얻어졌습니다. 모든 동물 실험은 2017-15-0201-01312 라이선스에 따라 덴마크 국가 규정에 따라 승인및 수행되었습니다.

주의: HIV에 노출된 쥐와 혈액을 극도의 주의로 다루세요. HIV와 접촉한 모든 표면과 액체를 확인된 HIV 소독제로 오염 제거합니다(재료표).

1. 인간 CD34+ 줄기 세포의 격리

  1. 계획된 제왕 절개 또는 질 출생 후 그리고 현지 윤리 적 승인에 따라 EDTA 코팅 혈액 수집 튜브에서 코드 혈액 샘플을 수집합니다.
  2. 제조업체의 프로토콜에 따라 밀도 구배 분리에 의해 제대혈로부터 PMBC를 분리합니다.
  3. 성숙한 세포를 위한 일반적인 마커에 대하여 항체를 첫째로 미리 풍부하게 함으로써 PBMC 인구에서 CD34+ 세포를 격리, 적혈구를 가진 원치 않는 계보의 세포의 가교를 유도하는. 이것은 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 구슬을 사용하여 CD34+ 세포 농축에 뒤따릅니다.
    1. 90 μL의 트립판 블루에서 10 μL의 셀 서스펜션을 재중단하여 표준 트라이판 블루 배제에 의한 라이브 셀 수를 결정합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 이 솔루션의 10 μL을 혈정계에 추가하고 비청색 셀을 계산합니다.
    2. 마우스 이식일까지 태아 소 혈청(FBS)에서 10% DMSO의 1 mL에서 CD34+ 세포를 유리하게 저온 보존합니다.
    3. CD34+ 줄기 세포 순도 평가(각 샘플의 ~30,000세포)를 평가하기 위해 분리된 세포(CD34+) 및 유동세포(CD34-)의 작은 분획을 유리하게 저온 보존한다. 또는 갓 농축된 세포에서 순도를 테스트합니다(아래 2단계 참조).
    4. CCR5Δ32 상태 측정을 위해 비펠흐름(CD34-)의 일부를 동결합니다. 세포는 컨디셔닝 된 동결 용액없이 직접 동결 될 수 있지만 펠렛에 적혈구가 존재하면 유동관통이 펠렛되는 경우 후속 PCR을 억제 할 수 있습니다.

2. 유세포 측정을 통한 CD34+ 줄기 세포 순도 평가

  1. 단리된 세포(CD34+) 및 유동-스루 셀(CD34-)을 해동한다. 인산완충식염수(PBS)에서 2% 태아 소 혈청(FBS)으로 구성된 실온(RT) FACS 완충액의 9 mL에서 각 바이알로부터 세포를 재중단시킴으로써 세포를 세척한다.
  2. RT에서 300 x g에서 5 분 동안 펠릿 세포로 원심 분리기.
  3. 상급체를 붓고 나머지 액체의 세포를 다시 일시 중단하고 FACS 튜브로 옮김하십시오. FACS 버퍼 3 mL로 세척 단계를 반복합니다. 두 번째 원심 분리 후 상층부를 붓고 나머지 액체에 있는 세포를 다시 일시 중단하십시오.
  4. Fc 수용체 차단 용액 5 μL(재료 표)를넣고 RT에서 10 분 동안 둡니다. Fc 수용체 차단 용액을 씻어 내지 마십시오.
  5. 인간 CD3(클론 SK7) BUV395, CD34(클론 AC136), FITC 및 CD45(클론 2D1) APC에 대해 소정의 항체를 포함하는 혼합물을 추가한다(표1). 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 세포를 둡니다. 형광단은 보상 매트릭스를 요구하지 않고 사용 가능한 유량 세포계로 평가할 수 있는 매개변수를 기반으로 선택해야 합니다.
  6. FACS 버퍼의 3 mL로 세포를 세척합니다.
  7. RT에서 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 펠렛 세포.
  8. 상급체를 붓고 나머지 액체에 있는 세포를 다시 중단하십시오.
    1. 이 세척 단계를 2x 반복하여 모든 언바운드 항체가 제거되었는지 확인합니다.
  9. 유량 세포계(재료표)에샘플을 기록하고 적절한 소프트웨어로 데이터 분석을 수행합니다. 게이팅 전략은 그림 1A-F에표시됩니다.

3. 코드 혈액에서 CCR5Δ32 변이체에 대한 유전자 검사

  1. 1.25 μL의 비펠트 플로우-200 μM의 dNTP 믹스, 0.01 U/μL 고충실도 DNA 폴리머를 함유하는 PCR 혼합물의 11.25 μL, 및 표 2에상세히 상세히 설명된 전진 및 후진 프라이머.
    1. 각 PCR 반응에 대해 뉴클레아제없는 물로 부피를 약 12.5 μL로 조정합니다.
  2. 표 3에자세히 설명된 PCR 사이클링 프로그램으로 게놈 조각을 증폭합니다.
  3. PCR 제품을 2% 아가로즈젤(13)에분리한다.
    1. 야생형 대문자와 Δ32 대문자의 PCR 제품은 각각 196개의 염기 쌍과 164개의 염기 쌍 대역의 PCR 단편을 산출하여 겔 전기동공13 (그림 1G)에의해 쉽게 구별할 수 있습니다.

4. 정맥 줄기 세포 이식

참고 : 한 사람이 실험실에서 세포를 준비하고 다른 사람이 이식을위한 마우스와 작업 공간을 준비하는 것은 효율적인 접근 방식입니다.

  1. 동물 시설에서, 줄기 세포의 계획된 이식 전에 4-6 시간, 조사 6-7 주 오래 된 여성 NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) 마우스(재료표)0.75 Gy와 Cs137 소스. 가장 좋은 사전 조절 복용량 마우스 나이 따라 달라질 수 있습니다., 방사선의 소스, 그리고 다른 요인. 이 과정은 인간 줄기 세포와 성공적인 생착을 위한 동물을 조건화합니다.
  2. 동물 시설에서 마우스 또는 세포를 작업 공간으로 가져오기 전에 흐름 벤치 작업 공간과 모든 시약을 준비합니다.
    1. 멸균 된 파란색 패드를 놓아 흐름 벤치의 작동 표면을 덮습니다. 멸균 거즈와 날카로운 용기를 준비합니다.
    2. 가열 램프를 70% 에탄올로 소독한 가열 램프를 열 아래에 빈 멸균 마우스 케이지가 있는 흐름 벤치에 놓습니다.
  3. 실험실에서, 분리된 CD34+ 세포를 해동하고 37°C 일반 RPMI의 9 mL에서 희석한다.
  4. RT에서 5 분 동안 350 x g의 세포를 원심 분리하고, 흡인에 의해 상급자를 버리고, 37 °C에서 일반 RPMI의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
  5. 트라이판 블루 배제에 의해 셀 수를 결정하고, 마우스당 200 μL로 볼륨을 조정한다. 후속 처리 단계로 인해 가능한 손실을 고려하기 위해 추가로 확인합니다.
    1. 각 마우스에 200 μL 당 75,000 CD34+ 세포를 이식할 준비를 하십시오.
    2. 세포는 이식 전에 동물 시설로 이송되는 동안 4°C에서 유지될 수 있다. 집결이나 응집을 줄이기 위해 얼음에 세포를 유지하지 마십시오.
  6. 동물 시설에서 마우스와 함께 케이지를 흐름 벤치로 가져와 가열 램프 아래의 케이지로 옮겨 혈관을 팽창시냅니다. 케이지의 한쪽 끝을 열원에서 멀리 두어 쥐가 따뜻해지면 열에서 멀어지도록 하십시오. 케이지의 끝으로 이동 한 마우스, 멀리 열원에서, 성공적인 꼬리 정맥 주입을 위해 충분히 따뜻하다.
  7. 1 mL 윤활 주사기를 부유 CD34+ 셀로 800 μL 마크 위에 적재하십시오. 윤활 된 1 mL 주사기를 사용하면 정맥 주사가 극적으로 완화되고이 기술의 정밀도가 향상됩니다.
  8. 30G 13mm 바늘을 부착하고 주사바늘과 주사기를 준비합니다. 이러한 동작 순서는 이러한 작은 게이지 바늘을 통해 세포의 급속한 흡인 중에 발생할 수 있는 가능한 손상을 감안할 때 이식될 세포의 무결성을 보호하면서 주사기를 더 빨리 적재할 수 있게 한다. 플런저를 눌러 액체로 바늘 허브를 채우고 바늘의 200 μL 마크까지 액체를 제거하십시오.
  9. 가열된 마우스(단계 4.6)를 IV 주사를 주는 데 사용되는 제자에 놓는다. 조심스럽게 마우스의 꼬리 정맥에 세포 현탁액의 200 μL을 주입합니다. 주사가 완료된 후 2 s를 보내고 주사를 마친 후 약 2s에 삽입된 바늘을 보관한다. 이것은 세포가 바늘의 제거의 앞에 주사 사이트에서 적당하게 멀리 이동했다는 것을 확인합니다.
  10. 필요에 따라 마우스 꼬리를 멸균 거즈로 닦아 눈에 보이는 혈액을 제거하십시오. 마우스를 가열되지 않은 홈 케이지에 다시 넣습니다. 나머지 마우스와 함께 주입 절차를 반복합니다.

5. 분석을 위한 혈액 수집 및 처리

참고: 말초 혈액에서 인간 세포 생착은 인간 줄기 세포 이식 후 3-5 개월 유세포 측정을 통해 평가 될 수있다.

  1. 국지 IACUC 승인 기술을 사용하여 마우스에서 혈액 샘플을 그립니다.
  2. 혈액의 응고를 피하기 위해 0.5 M EDTA (pH = 8.0)의 10 μL을 포함하는 멸균 된 PCR 미세 원심 분리튜브에 총 혈액의 최대 70-100 μL을 수집합니다.

6. 유세포측정을 통한 인간 생착평가

  1. FACS 튜브에 혈액의 40-50 μL을 전송합니다.
  2. 항체의 비특이적 결합을 방지하고 RT에서 10 분 동안 방치하기 위해 Fc 수용체 차단 용액 5 μL을 추가하십시오.
  3. CD4(클론 SK3) BUV 496을 함유하는 마우스 항인간 항체 믹스를 첨가하고, CD8 (클론 RPA-T8) BV421, CD3 (클론 OKT3) FITC, CD19 (클론 sj25c1) PE-Cy7, CD45 (클론 2D1) APC(표 4)및 30 분 동안 RT에서 어둠 속에서 얼룩을 남기고 30 분 동안 플루오로 포레스는 사용 가능한 매개 변수를 기준으로 선택되어야 합니다.
  4. 적혈구를 lyse 각 튜브에 적절 한 적혈구 lysing 버퍼의 2 mL를 추가 합니다. 적혈구 용해 전에 항체 염색을 위해 특별히 제형화 된 용해 완충액을 사용하십시오 (적합한 예는 재료 표에주어질 수 있습니다). 소용돌이는 용해 액에서 세포의 균등 한 분포를 보장하기 위해 짧게 RT. 세포의 동등한 분포가 중요하다.
  5. 2 mL의 FACS 버퍼를 추가하여 라시스 반응을 멈춥시합니다.
  6. RT에서 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 펠렛 세포.
  7. 세포가 다시 중단 될 때까지 상류와 소용돌이를 부드럽게 붓습니다.
  8. RT에서 300 x g에서 5 분 동안 FACS 버퍼와 원심 분리기 3 mL을 추가하십시오.
  9. 상급체를 붓고 세포를 다시 일시 중단하십시오.
  10. 적절한 유량 세포계에 샘플을 기록하고 적절한 소프트웨어(재료 표)를사용하여 분석합니다. 대표적인 분석 및 결과는 그림 2 및 그림 3에도시되어 있습니다.

7. 질 내 HIV 노출

참고: 마우스의 질 내 노출에 사용되는 바이러스는 이전에 게시된 프로토콜17을사용하여 생성될 수 있다. 바이러스는 -80 °C에서 보관되고 현지승인 프로토콜에 따라 드라이 아이스에 저장하면서 위치 간에 운반됩니다. 바이러스는 마우스의 노출 직전까지 드라이 아이스에 저장됩니다. 바이러스는 일반 RPMI로 희석될 수 있다(항생제 또는 혈청 첨가제를 가지는 RPMI를 피하십시오)는 노출 직전에 적절한 농도를 달성한다(21,400 IUs는 이 IVAG 노출에 사용되었다). 일단 생성되면, 희석된 바이러스가 해동되면 드라이 아이스에 다시 놓였을 때 발생하는 동결 해동 주기를 피하기 위해 절차 전반에 걸쳐 젖은 얼음에 희석 된 주식을 보관하십시오.

  1. 마우스 또는 바이러스를 유동 벤치로 가져오기 전에 그림 4에 제시된 대로 모든 장비 및 플로우 벤치 작업 공간을 준비합니다(4.2단계와 유사).
    1. HIV 노출 절차 중에 마우스가 위치할 작업 공간의 중앙에 가열 램프 초점을 배치합니다. 가열 램프는 마우스의 체온의 감소를 보장하지 않습니다. 온도를 제어하는 다른 장비도 사용할 수 있습니다(예: 가열된 젤 패드 또는 순환하는 따뜻한 물 담요, 현지 IACUC 규정18).
    2. 멸균 20 μL 파이펫 팁과 적절한 파이펫을 벤치에 가져오십시오. 바이러스와 접촉한 물질및 액체의 즉각적인 불활성화를 위해 액체 소독제(재료표)가있는 용기를 벤치에 놓습니다.
  2. 3% 이소플루란 가스와 종이 타월로 챔버에 마우스를 놓습니다. 가스의이 비율은 2-4 분 이내에 동물을 마취합니다. 면역 결핍 마우스와 함께 사용되는 다른 모든 물질과 마찬가지로 마취 장치는 사용하기 전에 적절하게 음독해야합니다.
  3. 마취되면, 가열 램프 아래 멸균 블루 패드에 마우스를 전송합니다. 마취를 유지하기 위해 연속 3 %의 이소플루란 가스를 공급하는 마스크에 마우스 주전자를 삽입하십시오. 그림 4에묘사 된 대로 마우스를 다시 지지하는 손으로 꼬리 의 밑부분에 마우스를 잡고 위를 향합니다.
  4. 멸균 피펫 팁으로 항문쪽으로 부드럽게 쓰다듬어 직장의 비우기를 유도하여 생식기 부위를 자극하여 질에 대한 압력을 완화하십시오.
  5. 조심스럽게 외음부가 자연스럽게 열리게 손가락에 마우스 꼬리를 감싸서 질 구멍을 베어, 아마도 멸균 파이펫 팁을 사용하여 약간의 이동과.
  6. 거품을 생성하지 않고 마우스 질에 바이러스의 피펫 팁과 파이펫 20 μL을 변경합니다. 팁을 질 깊숙이 삽입하지 마십시오. 오히려 외음부를 열면 피펫 팁을 질 개구부 수준에 놓고 접종 과정에서 찰과상을 제거하고 바이러스를 방출하고 중력이 바이러스를 질로 끌어 당길 수 있도록 더 깊게 가지 마십시오. 양자택일로, Veselinovic 외6에기술된 대로 22 G 1.25 mm 무딘 끝, 곧은 바늘을 사용하십시오.
  7. 바이러스 현탁액의 중력 유도 누설을 피하기 위해 노출 후 5 분 동안 질을 향하게하여이 위치에 마우스를 유지하십시오.
    1. 조심스럽게 홈 케이지에 마우스를 배치, 뒷면에 마우스를 배치주의.

8. 바이러스 부하 분석 전에 혈액 샘플의 처리

  1. 위의 섹션 5에 설명된 대로 혈액을 수집합니다.
  2. 혈장과 세포를 분리하기 위해 RT에서 500 x g에서 5 분 동안 혈액 샘플을 원심 분리합니다.
  3. 바이러스 부하 측정을 위한 플라즈마 40 μL을 새로운 멸균 PCR 승인 미세원심지 튜브에 넣고 추가 처리가 될 때까지 적어도 1시간 동안 -80°C에 보관합니다. RNA 분리 이전에 동결되지 않은 샘플에서 RNA 수준을 비교하여 RNA 격리 전에 냉동된 샘플과 RNA 분리 전에 동결된 시료를 비교하는 편견의 위험을 피하기 위해 RNA 추출 전에 모든 샘플을 동결하는 것이 중요합니다.
  4. 40 μL의 현탁액 매질(2.5% 소 혈청 알부민, 50 U/mL 페니실린 G 및 스트렙토마이신, 0.22 μm에서 멸균 된 10 U/mL DNase)을 추가하여 혈액의 양을 원래 볼륨으로 조절하십시오.
  5. 조정된 혈액 량의 15 μL을 새로운 PCR 승인 미세 원심 분리튜브로 옮김.
  6. 1 mL의 1 mL을 추가하십시오 1 x RBC 용해 용액(재료 표),소용돌이, RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
  7. RT에서 9,600 x g에서 펠릿 세포로 1 분 동안 원심 분리기.
  8. 흡인 상피 및 작은 백혈구 펠릿만 두고, 적혈구 오염은 PCR을 억제할 수 있기 때문에.
  9. 펠릿을 -80°C에서 추가 처리될 때까지 적어도 1시간 동안 보관하십시오.
    참고: 선택적으로, 단계 8.4로부터의 잔여 혈액은 6단계에서 전술한 바와 같이 유세포분석분석에 사용될 수 있다.

9. 단백질성 K 추출 방법을 이용한 DNA 추출

  1. 아래와 같이 단백질분석K 추출방법을 이용하여 말초세포 펠릿(단계 8.8에서 생성)으로부터 DNA를 추출한다. 이 방법은 본 연구에서 활용되는 직렬 혈액 수집에 필요한 것과 같은 소량의 혈액으로부터 가장 높은 DNA 수율을 추출하는 것으로 입증되었다19.
  2. 0.1M 트리스 완충제 의 1 mL에 단백질 화 K (20 μg / mL)의 25 μL을 추가합니다.
  3. 단백질성 K 용액을 간략하게 소용돌이.
  4. 소화될 각 세포 펠릿에 50 μL의 단백질분해제 K 용액을 첨가한다.
  5. 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 세포 펠릿의 재현탁액을 확인합니다.
  6. 400rpm(기기에 따라 다름)에서 열셰이커(재료표)를흔들어 56°C에서 1시간 동안 테이프 튜브를 내려놓고 필요한 경우 제자리에 고정시십시오.
  7. 즉시 동일한 써모셰이커에서, 95°C로 온도 이동을 가진 단백질나아제 K를 비활성화하고 흔들림은 추가로 20분 동안 계속된다.
  8. 각 샘플을 소용돌이.
  9. 각 샘플을 최소 30분 동안 -80°C에 놓습니다.
  10. 해동한 다음 RT에서 1분 동안 17,000 x g의 샘플을 원심분리하여 원치 않는 세포 단편을 펠릿합니다.
  11. DNA 함유 상급물질을 새로운 미세원원지 튜브에 넣습니다.
  12. DNA 템플릿은 PCR에 대한 준비가되어 있습니다. DNA 템플릿은 -80°C에서 저장될 수 있다.

10. RNA 추출, cDNA 합성 및 바이러스 RNA의 ddPCR 정량화

  1. 제조업체의 프로토콜에 따라 바이러스 RNA 격리 키트로 해동된 마우스 플라즈마로부터 RNA를 분리합니다(재료표).
  2. 샘플을 컬럼에 첨가한 후, 온컬럼 DNase 처리 단계를 추가하여 혈장 샘플내의 모든 DNA를 제거할 수 있도록 한다.
    1. 각 샘플에 대해 95 μL의 RNase 프리 DNase 용액(2 μL RNA제 프리 DNase 및 98 μL 반응 버퍼 혼합)을 컬럼에 넣고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
  3. RNA 샘플을 추가 처리 전에 적어도 1시간 동안 -80°C에 저장합니다. RNA 추출 후 모든 샘플을 동결하지 않은 샘플과 동결된 샘플을 비교할 때 편향의 위험을 피하는 것이 중요합니다.
  4. 앞서20일설명한 바와 같이 시약을 이용한 역전사 단계를 이용하여 cDNA를 합성한다. RNA의 분해를 피하기 위해 cDNA 반응에 RNase 억제제의 0.5 μL을 추가하십시오.
    1. 표 5에상세히 설명된 프로그램으로 cDNA 합성을 수행한다.
  5. cDNA 샘플을 적어도 1시간 동안 -80°C에 저장한다. cDNA 합성 후 모든 샘플을 동결하지 않은 샘플과 동결되지 않은 샘플을 비교할 때 편향의 위험을 피하는 것이 중요합니다.
  6. 다음과 같이 ddPCR에 대한 샘플을 준비20:
    1. ddPCR 프로브 혼합물(dUTP 없음)의 11 μL과 cDNA 샘플의 3 μL을혼합하여 20,250 nM 마이너 홈-결합 프로브, 및 각 순방향 및 역방향 프라이머의 900 nM을 표 6에상세히 기재하였다.
    2. 뉴클레아제없는 물로 총 PCR 부피를 22 μL로 조정합니다.
  7. 제조업체의 프로토콜 및 이전 설명20에따라 액적 발생기에서 프로브용 액적 생성 오일과 PCR 혼합물을 유화합니다.
  8. 표 7에자세히 설명된 대로 PCR 프로그램을 실행합니다.
    참고: 여기에 표시된 프라이머/프로브 시퀀스 및 PCR 프로그램은 HIV 균주 RHPA4259의 민감한 검출을 위해 특별히 설계및 최적화되었습니다. 프라이머 및 프로브 서열은 쉽게 조정하여 다른 HIV 변형을 감지할 수 있습니다.
  9. 액적 판독기에서 샘플에서 액적 형광을 검출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 적절한 소프트웨어로 결과를 분석합니다.

11. cART 함유 차우로 처리

  1. 4,800 mg/kg의 랄테그라비르(RAL), 720 mg/kg 테노포프로실 푸마레이트(TDF) 및 520 mg/kg 엠트리시타빈(FTC)21(표 8)을함유하는 표준 cART 요법을 함유하는 펠릿을 함유한 마우스에게 사료를 공급한다. 이 복용량은 마우스의 무게가 25g이고 하루에 4g의 차우를 먹는다고 가정하여 결정되었습니다. 이는 일일 복용량 768 mg/kg RAL, 2.88 mg/kg TDF, 83 mg/kg FTC21에해당합니다.
  2. 처방약의 외부 공급 업체 (재료 표참조)에서 제조 한 cART 식단을 사용하십시오. 다른 회사는 잠재적으로이 처방을 생산할 수 있습니다. 일반 마우스 차우와 쉽게 구별하기 위해 빨간색으로 착색 된 cART 다이어트를 사용합니다.
    1. 쉽게 구별할 수 있는 표준 브라운 컬러의 cART 없이 컨트롤 차우 다이어트를 생산합니다.
  3. cART의 개시를 위해, cART 를 포함하는 차우 규정식의 추가와 더불어 살균 마우스 케이지를 준비하고, 그 때 새로운 케이지에 오래된 케이지에서 마우스를 전송합니다.
    1. 육안 검사를 통해 마우스의 중량과 cART 함유 차우의 소비를 모니터링하여 마우스가 변화에 적응하고 있는지 확인합니다.

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결과

줄기세포 순도 분석을 위한 게이팅 전략은 도 1에도시되어 있다. 도 1A-C는 정제된 CD34+ 인구 및 도 1D-F-흐름-CD34-흐름-절연 과정에서 CD34+ 인구의 최소량이 손실된다는 것을 설명하기 위해 사용된다. 단리된 CD34+ 줄기 세포의 순도는 85%-95% 사이였으며 1% 미만의 T 세포 오염을 가하였다. 그림 1G는 CCR5Δ32/wt 유전자형을 가진 1명의 성인 인간 통제 기증자에서 CCR5 밴드를, 2개의 CCR5wt/wt 및 1개의 CCR5Δ32/wt ...

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토론

가혹하게 면역 손상된 마우스 변형 NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac(NOG)는 인간 세포 및 조직의 이식에 매우 적합합니다. 이 마우스에 있는 선천적이고 적응적인 면역 통로 둘 다 손상됩니다. NOG 및 NSG 마우스는 결함이 있는 T 및 B 세포 기능을 초래하는 Prkdcscid 돌연변이를 품고 있습니다. 더욱이, 이들 마우스는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21과 같은 많은 주요 사이토카인의 결합 복합체에 없어서는 안 될 기능적인 인터류킨-2 수용체 γ사슬(common gamma chain, IL2rg)이 결여되어 있다. NOG와 같은 면역 결핍 마우스는 인간 면역 계통으로 이식되어 HIV 전염 및 면역학 연구를 위한 강력한 도구입니다. 인간화된 마우스를 이용하여 이루어진 이러한 분야에서의 기여는2,...

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공개 사항

저자는 이해 관계의 충돌을 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 오르후스 대학의 생물 의학 동물 시설 직원, 특히 식민지 유지 보수 노력과 마우스 무게를 추적하기위한 Jani Kær 씨에게 감사드립니다. 저자는 표준 치료 cART를 개발하고 지도에 대한 플로리안 클라인 교수에게 감사드립니다. 다음 시약은 NIH 에이즈 시약 프로그램, 에이즈 학과, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (고양이# 11744) 존 카페스 박사와 크리스티나 오크센바우어 박사를 통해 얻어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파란색 패드VWR56616-031사용 전에 멸균해야 합니다
소 혈청 알부민(BSA)SigmaA8022
CD19(클론 sj25c1) PE-Cy7BD Bioscience557835
CD3(클론 OKT3) FITCBiolegend317306
CD3(클론 SK7) BUV395BD Bioscience564001
CD34(클론 AC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (클론 SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (클론 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (클론 RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263현탁액 완충액
dNTP mixLife TechnologiesR0192
Dulbeccos 인산염 완충 식염수(PBS)BiowestL0615-500
EasySep 인간 제대혈 CD34 포지티브 선택 키트 II줄기세포17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS 용해 용액 10XBD349202사용 직전 dH20에 1:10 희석
FACS 튜브(Falcon 5mL round-botton)Falcon352052
Fc 수용체 차단 용액(Human Trustain FcX)Biolegend422302
소 태아 혈청SigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
GauzeMesoft157300사용 전에 멸균해야 합니다
. 가열 램프맞춤형
헤마사이미터(Bü rker-Tü rk)VWRDOWC1597418
Isoflurane 가스Orion Pharma9658
LSR Fortessa X20 유세포 분석기BD
마이크로 원심분리기 튜브, PCR-PT 승인Sarstedt72692405
마우스 cART 식품ssniff Spezialdiä ten GmbH맞춤형 제품
마우스 구속기맞춤형 제품
Needle, Microlance 3, 30G ½ "BD304000
NOG 마우스 NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
뉴클레아제가 없는 물VWR 화학 물질436912C
Nucleospin 96 바이러스 DNA 및 RNA 분리 키트Macherey-Nagel740691
PCR 승인 마이크로 원심분리기 튜브Sarstedt72.692.405
페니실린-스트렙토마이신 용액 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II DNA 중합효소Life TechnologiesF549S
피펫 팁, sterile, ART 20P BarrierThermoScientific2149P
Proteinase KNEB100005398
QuantaSoft 소프트웨어, Bio-Rad
QX100 액적 발생기Bio-Rad1886-3008
QX100 액적 리더Bio-Rad186-3003
RBC 용해 용액Biolegend420301
RNase-free DNAse 크기 F + 반응 버퍼Macherey-Nagel740963
RNAseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제ThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500H20
Softject 1 mL 주사기Henke Sass Wolf5010-200V0
Superscript III Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific18080044
ThermoshakerVWR89370-910
Trypane blueSigmaT8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0ThermoFisher Scientific15575-020
Virkon S (바이러스 소독제)듀퐁7511
: 용 , 에 용해년

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