방법 논문

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

DOI:

10.3791/60728

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2020년 5월 17일

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1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

초록

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근접 라벨링(PL) 기술은 엔지니어링된 아스코르브베이트 과산화수배 (APEX) 또는 대장균 비오틴 리가제 비라(BioID로 알려짐)를 사용하여 포유류 세포에서 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 식별하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나 APEX 기반 PL에서2독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항, 비오틴(16-24시간)의 배양 시간 연장, BioID 기반 PL의 더 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물에서의 적용을 심각하게 제한합니다. 최근에 설명된 TurboID 기반 PL은 BioID 및 APEX의 많은 한계를 해결합니다. TurboID는 실온(RT) 조건에서 단 10분 만에 단백질의 신속한 근접 라벨링을 허용합니다. TurboID의 유용성은 동물 모델에서 입증되었지만, 우리는 최근 터보 ID 기반 PL이 관심있는 단백질에 근접한 단백질의 라벨링에 대한 BioID에 비해 식물에서 더 나은 성능을 보였다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 뉴클레오티드 결합 류신-리치 반복(NLR) 단백질 패밀리의 N-말단 톨/인터류키핀-1 수용체(TIR) 도메인을 이용하여 단백질 상호작용 파트너의 식별을 위한 단계별 프로토콜이다. 이 방법은 친화도 정제에 의한 생체 연단백질의 벡터 구성, 단백질 발현 구조, 비오틴 처리, 단백질 추출 및 탈염, 정량화 및 농축에 대해 설명합니다. 여기에 기술된 프로토콜은 니코티아나 및 다른 식물 종에서 관심 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

서론

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PPI는 다양한 세포 과정의 기초입니다. PPI를 확인하기 위한 전통적인 방법은 질량 분석법 (IP-MS)와 결합된 효모 2 하이브리드 (Y2H) 검열 및 면역침전을 포함합니다 1. 그러나 둘 다 몇 가지 단점으로 고통받고 있습니다. 예를 들어, Y2H 스크리닝은 표적 식물 또는 동물 종의 Y2H 라이브러리의 가용성을 요구한다. 이 도서관의 건설은 노동 집약적이고 비싸다. 더욱이, Y2H 접근법은 더 높은 진핵 세포의 세포 상태를 나타내지 않을 수 있는 이종 단세포 진핵 생물 효모에서 수행된다.

대조적으로, IP-MS는 일시적 또는 약한 PPI를 포착하는 데 있어 낮은 효율을 나타내며, 또한 낮은 풍부하거나 높은 소수성을 가진 단백질에 적합하지 않다. 수용체 같이 키나아제 (RLKs) 또는 면역 수용체의 NLR 가족과 같은 식물 신호 통로에서 관련시킨 많은 중요한 단백질은 낮은 수준에서 표현되고 수시로 그밖 단백질과 일시적으로 상호 작용합니다. 따라서, 그것은 크게 이러한 단백질의 조절의 기본 메커니즘의 이해를 제한.

최근에는 엔지니어링된 아스코르베이트 과산화수산아제(APEX)와 돌연변이 대장균 리게틴 리가제 비라R118G(B....

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프로토콜

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참고: 메서드의 개요는 그림 1에나와 있습니다.

1. 식물 재료 준비

  1. 고밀도로 젖은 토양에서 N. 벤타미아나 씨앗을 재배하고 23-25 °C에서 16 h 빛 (약 75 μmol /m2s) 및 8 h 어두운 광주기를 가진 기후 챔버에서 유지합니다.
  2. 약 1 주일 후, 조심스럽게 4 'x 4'냄비에 각 젊은 묘목을 전송하고 같은 챔버에 묘목을 유지.
  3. 약 4주 동안 챔버내식물을 유지하여 후속농윤(15)을위해 4-8의 잎 단계로 자랄 때까지 유지한다.

2. 터보 ID 융합의 건설

  1. 표준 분자 복제 기술을 사용하여 목표 단백질과 터보ID(아드진 플라스미드 #107177 PCR TurboID)와 의 융합을 생성합니다. 여기서, 우리는 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인을 관심의 표적 단백질로 사용하고 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어 하에 터보ID에 융합된 TIR을 구성하였다(p35S::TIR-TurboID).
    참고: 터보ID 효소를 표적 단....

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결과

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설명된 프로토콜에 기초하여 예상되는 결과를 나타내는 대표적인 데이터는 Zhang et al11에서조정된다. 그림 1은 N. 벤타미아나에서터보ID 기반 PL을 수행하기 위한 절차를 요약한 것입니다. 도 2는 침윤된 N. 벤타미아나 잎에서단백질 발현 및 생체이식화를 나타낸다. 도 3은 침윤된 잎내의 생체티니화 단백질이 후속 질량 분석 분석을 위해 효율적으로 농축되었다는 것을 보여준다. streptavidn-C1-컨쥬게이션 된 자기 구슬을 사용하여 생체 관절 단백질을 농축 한 후 다양한 크기의 다른 단백질이 포착되었으며 농축 된 단백질의 서쪽 얼룩 분석이 얼룩진 밴드를 보였다는 점에 유의해야합니다(그림 3). 유사한 관측은 몇몇 최근 간행된

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토론

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터보ID 비오틴 리가제는 바이오ID10의효모 디스플레이 기반 의 방향 진화에 의해 생성된다. 그것은 다른 PL 효소에 비해 많은 장점을 갖는다. TurboID는 최적의 성장 온도가 약 25 °C10인파리와 웜을 포함한 다른 모델 시스템에 PL을 적용 할 수 있습니다. PL 접근법은 동물 시스템에서 널리 사용되어 왔지만 식물에서의 적용은 제한적입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 식물-병원체 상호 작용 연구에서 널리 사용되고 있는 모델 공장인 N. 벤타미아나에TurboID 기반 PL을 확립하기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 잎 샘플 준비, 자유 비오틴 제거, 추출된 단백질의 정량화 및 생체 티니화 단백질의 농축을 설명합니다.

동물 세포 배양 시스템에서 자유 비오틴은 PBS 완충액4로세포를 세척함으로써 크게 제거될 수 있지만, .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 사업은 국립 트랜스제닉 과학 기술 프로그램(2019ZX08010-003 ~ Y.Z.), 중국 국립 자연과학 재단(31872637 ~ Y.Z.), 중앙대학 기초연구기금(2019TC028 ~Y.Z.), NSF-IOS-1344의 보조금으로 지원되었다. NSF-IOS-1339185 및 NIH-GM132582-01~ S.P.D.K.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
721 분광 광도계Metash, Made inQ/SXFZ6OD600 측정용
모늄 바이카보네이시그마A6141-500G
비오틴시그마B4639-1G50 mM 재고
원심분리기EppendorfCentrifuge 5702
원심분리기Eppendorf원심분리기 5417R
cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일Roche11697489001
Deoxycholic acidSigmaD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001친화성 정제용
EDTASigmaE6758-500G
ELISA 플레이트CorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
염산(HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF 멤브레인MilliporeIPVH00010웨스턴 블롯 분석용
리튬 염화 용액(LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
저속 냉장 원심분리기Zonkia, 중국산KDC-2046탈염용
, 육수화물(MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
마그네틱 랙Invitrogen123.21D비드 흡착용
Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계Thermo Fisher ScientificN07710OD595 측정용
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
쥐 안티 HA로슈11867423001
회전 믹서Kylin-Bell 실험실 기기WH-986IP
쇼크 인큐베이터Labotery, 중국에서 만든ZQPZ-228
염화나트륨 (NaCl)피셔 사이언티픽S271-3
나트륨 데 옥시 콜레이트시그마D2510-100G
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)시그마L4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma base시그마T1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
워터 재킷 인큐베이터블루 파드, 중국산GHP-9080Agrobacterium 인큐베이션
Zeba 스핀 탈염 컬럼Thermo Fisher Scientific89893비오틴 제거용
China 암트 염화마그네슘

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Bio....

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TurboIDNLRNicotiana benthamiana

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