방법 논문

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

DOI:

10.3791/60808

⸱

2020년 4월 2일

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1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

초록

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유전자 변형 (GM) 마우스의 사용은 유전자 기능을 이해하고 인간 질병의 기본 메커니즘을 해독하는 데 중요해졌습니다. CRISPR/Cas9 시스템을 통해 연구자들은 전례 없는 효율성, 충실도 및 단순성으로 게놈을 수정할 수 있습니다. 이 기술을 활용하여 연구원들은 GM 마우스를 생성하기 위한 신속하고 효율적이며 쉬운 프로토콜을 찾고 있습니다. 여기에서 우리는 동결 해동 된 배아의 더 높은 발달 속도로 이어지는 1 세포 배아의 냉동 보존을위한 개선 된 방법을 소개합니다. 최적화된 전기 천공 조건과 결합함으로써 이 프로토콜은 짧은 시간 내에 고효율 및 낮은 모자이크 비율로 녹아웃 및 노크인 마우스를 생성할 수 있게 합니다. 또한, 우리는 CRISPR 시약 준비, 체외 수정, 동결 보존 및 1 세포 배아의 동결 보존 및 해동, CRISPR 시약의 전기 천공, 마우스 생성 및 설립자의 게놈을 포함하는 최적화 된 프로토콜에 대한 단계별 설명을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 연구원은 비교할 수 없는 용이성 GM 마우스를 준비 수 있어야, 속도, 그리고 효율성.

서론

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클러스터된 정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 시스템은 게놈1에있는 전례 없는 표적으로 한 수정을 제공하는 과학적인 돌파구입니다. CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(gRNA)와 표적 특이적 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 CRISPR RNA(트라크RNA)2로 구성됩니다. gRNA는 Cas9 단백질을 게놈내의 특이적 궤적, 20개의 뉴클레오티드가 crRNA에 상보적이며, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접하여 지시한다. Cas9 단백질은 표적 서열에 결합하고 오류가 발생하기 쉬운 비동동성 단부 접합(NHEJ) 또는 고충실도 상동성 상동성 수리(HDR)3,,4,,5에의해 수리되는 이중 가닥 파손(DSB)을 유도합니다. NHEJ는 삽입 및 /및 삭제 (indels)로 이어지며, 따라서 코딩 서열이 표적화 될 때 기능의 유전자 손실로 이어집니다. HDR은 상동성 서열을 포함하는 복구 템플릿의 존재에 정확한 게놈 편집에 이....

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프로토콜

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이 연구에서 수행된 모든 동물 관리 및 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드의 규칙 및 규정에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 도야마 대학, 도쿄 대학, 지치 대학, 맥스 플랑크 플로리다 신경 과학 연구소의 실험실 동물의 동물 관리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 시약에 대한 정보는 재료 표에표시되어 있습니다.

1. CRISPR 시약 설계

  1. crRNA 디자인
    1. CRISPR 다이렉트19 19(https://crispr.dbcls.jp/)를 방문하여 오프타겟 사이트가 줄어든 특정 crRNA를 설계합니다.
      참고: crRNA 20(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/)을20 디자인하는 다른 많은 유용한 도구가 있습니다.
    2. 표적 뉴클레오티드 서열을 삽입하고 다음과 같은 변경을 수행합니다.
      PAM 시퀀스 요구 사항 = NGG
      특이성 검사 = 마우스 (무스 근육) 게놈, GRCm38 / mm10 (2011 년 12 월)
      참고: 일례로, 티로시나제(Tyr) 녹아웃 마우스를 생성하기 위해, 엑....

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결과

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1M DMSO 및 DAP213 용액에서 동결 보존을 한 후 10 분 동안 20 % FBS를 함유하는 HTF에서의 배양을 포함한 1 세포 배아의 냉동 보존을위한 우리의 수정 된 방법은 동결 해동 된 배아의 발달 속도를 2 세포 단계로 향상시켰습니다(그림 1, p = 0.009, 학생 t-test). 동결 해동 배아는 GM 마우스의 생산을 위해 사용되었고 전기 포어화 조건은 최적화되었다: 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 전기포더레이터를 사용하여 3 ms 펄스와 97 ms 간격으로 25 V의 5회 반복. 프로토콜의 적용성은 알비노 티로시나아제 유전자(Tyr) 녹아웃 마우스의 생성에 의해확인되었다(도 2). 이를 위해, gRNA 표적화 엑손2(도 2A)와CRISPR 시약을 프로토콜 섹션에 기재한 대로 제조하였다. 편집 도구는 게놈의 첫 번째 복제 전에 발생 게놈 편집을 보장하.......

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토론

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기재된 프로토콜은 높은 효율과 낮은 모자이크 레이트(표1)를가진 GM 마우스의 생성을 허용한다. CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로테인(RNP) 및 동결 해동 배아로의 전기 화: 생식 공학 및 게놈 편집 기술 모두에서 가장 유용한 최신의 진보를 활용하기 때문에 고급 배아 조작 기술이 없는 연구원은 돌연변이 마우스를 쉽게 만들 수 있습니다. 이러한 발전은 GM 마우스의 생성을 촉진하고 신속히 진행하였다. 도 3에기재된 바와 같이, GM 마우스를 생성하는 데 ~4주가 걸린다. 유사한 접근법26을사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리의 방법은 효율성, 출산율 및 모자이크의 측면에서 우수하다.

동결 보존 전에 FBS에서 1 세포 배아의 배양은 배아의 발달 속도를 개선하는 데 중요합니다. 프로토콜에 기술된 저온 보존 배아의 전기 천공 조건은 CRISPR 시약의 편.......

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공개 사항

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저자는 관련 재무 공시가 없습니다.

감사의 글

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사와다 히토미와 엘리자베스 가르시아에게 동물 보호에 감사드립니다. 이 작품은 KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 및 16K01946)와 호쿠긴 연구 보조금 (H.N.에), 그리고 지치 의과 대학 젊은 조사상 (H.U.)에 의해 지원되었다. 오츠카 토시미 장학재단은 M.D.를 후원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25 M 자당ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)SUCROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (일본 도쿄)Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
C57BL/6J 마우스일본 SLC(일본 하마마츠)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (미주리주 세인트루이스)ES-009-C
hCGMOCHIDA Pharmaceutical Co., Ltd. (일본 도쿄)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)HTF
ICR 마우스일본 SLC (일본 하마마츠)N/A
IsofluranePetterson Vet Supply, Inc. (콜로라도주 그릴리)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)M2
MedetomidineNippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. (Koriyama, Japan)1124401A1060
MicroscopeNikon Co. (Tokyo, Japan)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tokyo, Japan)1124401A1060
Nuclease free bufferIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Nucleospin DNA extraction kitTakara Bio Inc (쿠사츠, 일본)740952 .5
원 홀 슬라이드 글라스Matsunami Glass Ind. (키시와다, 일본)S339929
원스텝 타입 ElectroporatorBEX Co., Ltd. (도쿄, 일본)CUY21EDIT II
파라핀 리퀴드NACALAI TESQUE Inc. (교토, 일본)SP 26137-85
백금 플레이트 전극BEX Co., Ltd. (도쿄, 일본)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (일본 도쿄)SEROTROPIN 1000
포비돈 요오드화물Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
환원혈청 최소 필수 배지: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
2단계 타입 ElectroporatorNepa Gene Co., Ltd. ( 일본 이치카와)NEPA21

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease ....

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재인쇄 및 허가

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태그

CRISPR Cas9

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