AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

1980년대^1호에발명된 이래, 원자력 현미경(AFM)은 나노미터 이하의 공간 분해능, 서브피코뉴턴 힘 분해능 및 다양한 용매 및 온도 조건에서 측정할 수 있는 가능성을 특징으로 하는 자연과학에서 가장 중요한 이미징 기술 중 하나가^{되었으며, 2,3,34,,5,46,7.,7}

^,이미징^8,9,AFM은 단일 중합체와 표면 간의 접착제 상호 작용, 단일 중합체의 물리적 특성 및 단백질^,7,^{,7,10,11,,12,,13,14,15,16}사이의 점착 작용에 대한 통찰력을 제공하는 단일 분자 힘 분광법 (SMFS)을 수행하는 데 사용됩니다.^,, 정기적인 SMFS 실험에서 기능화된 캔틸레버 팁이 표면과 접촉하여 AFM 캔틸레버의 폴리머가 이 표면에 물리를 수 있도록 합니다. 표면에서 AFM 캔틸레버 팁을 후퇴시킴으로써, AFM 캔틸레버의 편향의 변화는 힘 연장^{곡선(4)으로}이어지는 힘으로 변환된다. 연신력, 탈착력 및 탈착 길이와 같은 물리적 파라미터는 당기기 속도, 표면에 거주 시간, 표면에 대한 들여쓰기 깊이, 온도, 용매^17,,18 및 고체 기질, 폴리머 필름 또는 지지성 지질 이중층^{19,20,,,,21, 22와}같은 상이한 파라미터에 따라 결정될 수 있다.²¹ 더욱이, 중합체는 상이한 공간 방향으로 조사될 수 있고, 따라서 중합체^{23,,24,,25,,26의}마찰 특성을 조사한다.

조사된 폴리머를 AFM 캔틸레버 팁에 공유 부착하는 것은 이러한 연구에 필수적입니다. 따라서, AFM 캔틸레버 팁에 결합된 하나의 단일 분자 발생물의 높은 수율은 AFM 캔틸레버^27,,28,다양한 부착점²⁹ 또는 다양한 폴리머(상이한 윤곽 길이)의 보정으로 인한 결과의 어떠한 편향도 방지한다(다양한 윤곽 길이)는 나노피싱 실험의 경우^{30,,31, 32.,32} 또한, 다른 중합체와의 상호 작용뿐만 아니라 평균 효과는 널리 방지 될 수있다^18,,28. AFM 캔틸레버 팁에 폴리머를 공유 부착하기 위해 다양한 유형의 화학 적 변형을 적용 할 수 있으며, 그 중 많은 부분이 Hermanson^33에의해 책에 요약되어 있습니다. 아민 및 티올 기반 연결 반응뿐만 아니라 클릭 화학은 AFM 캔틸레버 팁 기능화^{34,,35,,36,,37,38, 39,,39,,40,,41, 42에서}가장 일반적으로 사용되는 방법을 나타낸다.^41, Becke et al.^40은 AFM 캔틸레버 팁에 단백질을 부착하기 위해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디미드(EDC)/NHS 화학을 사용하는 방법을 보여준다. 그러나, 이러한 작용기는 상호 연결되는 경향이 있어 기능의 손실로 이어진다^43,,44. 또한, 카보디마이드는^{용액(43)에서}가수분해가 빠른 경향을 보여준다. 말레미드와 티올 그룹은 일반적으로 더 안정적이며 가교 반응을 보이지 않습니다. 제시된 프로토콜은 참조^35,,39에주어진 이전에 게시된 프로토콜의 최적화이다.

여기서, 등고선 길이 또는 소수성등의 성질에 관계없이 많은 수의 상이한 중합체로 용이하게 조절할 수 있는 신뢰할 수 있는 기능화 프로토콜이 제시된다. 3개의 상이한 중합체는 예를 들면: 친수성 폴리에틸렌N글리콜 (PEG) 및 폴리 (N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) 뿐만 아니라 높은 몰 질량 소수성 폴리스티렌 (PS). 적절한 링커 분자를 가진 공유 결합 기능을 제공하기 위해, 3개의 중합체는 기능성 말단군으로서 텔레첼릭 티올 모에티를 특징으로 하기 위해 선택되었다. 링커 분자 자체는 전형적으로 2개의 활성 부위를 가진 짧은 PEG 중합체, 한쪽 끝에 실란 군 및 다른 쪽 끝에 있는 말미마이드 그룹이다. 전자는 AFM 캔틸레버 팁에 공유 부착을 가능하게 하고 후자는 기능화된 고몰 질량 중합체의 티올 기와 결합 반응을 가능하게 한다. 또한 비활성 PEG 링커 분자는 프로브 폴리머와 AFM 캔틸레버 팁 뿐만 아니라 AFM 캔틸레버 팁과 기본 표면 사이의 원치 않는 상호 작용을 방지하는 패시베이션 층역할을 합니다.

참고: 회로도 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. 시약 설정

참고 : 이 프로토콜에 사용되는 중합체는 다음과 같습니다 : 말미드 폴리에틸렌 글리콜 트리에톡시실란 (실란 - PEG-말, 5 kDa), 티올 폴리에틸렌 글리콜 티올 (HS-PEG-SH, 35 kDa), 티올 종단 폴리(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) 및 티올 종단 폴리스티렌 (PS-SH, 1.3 mDa).

1. 원자 전달 라디칼 중합을 통해 잘 정의된 고 어금니 질량 PNiPAM-SH를 준비하고, 그 다음에 문헌^18에기재된 바와 같이 티올 모에티의 도입을 위한 기능성 말단기의 전환 및 감소를 준비한다. 자세한 구조는 그림 1을 참조하십시오.
2. 화학 물질의 저장을 위해, 대기 산소와 습기에 노출을 피하기 위해 질소 분위기와 건조 글로브 박스 시스템 내에서 작은 aliquots을 준비합니다. PEG 및 PNiPAM은 흡습성^45,,46 및 PEG, PNiPAM 및 PS의 기능적 단부가 주변 조건^{33,47,,48에서}저장될 때 쉽게 산화되는 것으로 알려져 있다.^, 모든 화학 물질은 -20 °C에서 보관해야합니다.
3. 분석 등급 용매 이상사용. 또한 단일 분자 실험은 모든 오염에 매우 민감하기 때문에 초순수를 사용하여 AFM 캔틸레버 칩과 유리 제품을 헹구십시오.

2. 장비 설정

참고: 핀셋과 비커는 스테인리스 스틸 또는 유리로 만든 사용주입니다. 안전한 그립을 위해 반전된 핀셋을 사용합니다(예: 낮은 스프링 상수를 갖는 모델 R3 SA).

1. 유리 제품 및 핀셋을 청소하기 위해 RCA (초순수, 과산화수소 및 암모니아 (5: 1:1)) 솔루션을 준비하십시오.
2. 용기를 비커에 넣고 유리 제품이나 핀셋이 완전히 덮일 때까지 RCA로 채웁니다.
3. 80 °C에서 1 시간 동안 2.2 단계에서 비커를 가열합니다.
4. 매운 냄새가 더 이상 (적어도 세 번) 확인할 수 없을 때까지 초순수로 용기를 헹구는다.
5. 오븐 (120 °C)에 건조 유리 제품 및 핀셋.

3. 팁 기능화

참고 : 모든 단계는 유기 증기의 흡입을 피하기 위해 연기 후드에서 수행해야합니다. 또한 장갑, 실험실 코트 및 눈 보호가 필요합니다. 오염을 피하기 위해 모든 단계에 니트릴 또는 라텍스 장갑을 사용하십시오. 톨루엔을 사용할 때는 용매 내성 장갑을 착용하십시오. 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 RT에서 수행됩니다.

1. AFM 캔틸레버 칩 MLCT-Bio-DC에 산소 플라즈마를 적용하여 표면 활성화를 수행합니다.
   참고 : 추가 기능화 단계를위한 플라즈마 처리의 효율은 플라즈마 챔버내의 산소 함량과 함께 확장됩니다.
   1. 새로 세척된 핀셋을 사용하여 AFM 캔틸레버 칩을 플라즈마 챔버(40kHz, 600W)에 놓습니다.
   2. 사용자 정의 수정 활성화 프로그램을 사용: 대피 (0.1 mbar) – 의 압력에 산소 홍수: 0.2 mbar (4 분) – 플라즈마 프로세스 (전원: 40%, 기간: 2 분, 공정 압력: 0.2 mbar).
   3. AFM 캔틸레버 칩에 오염물질이 공기에 흡착되는 것을 방지하기 위해 챔버를 환기시키고 즉시 3.2.2 단계로 계속 진행하십시오.
2. 실란화 및 PEGylation
   참고: 타이밍은 단계 간의 중요한 매개 변수입니다. 대기 시간 동안 가능한 한 신선한 솔루션을 준비합니다. 말레미드 기는 수성 매체에서 가수분해를 받고 티올은 용액^33,,47에서 이황화로 쉽게 산화되어 AFM 팁 기능화 반응을 방해한다.
   1. 실란-PEG-말 용액을 용매 내성 플라스틱 또는 유리 튜브에 톨루엔(1.25 mg/mL)으로 준비하고 평평한 페트리 접시에 6 mL의 용액을 부어 각각 3 mL.
      참고: SMFS 실험에서 여러 프로브 폴리머의 결합이 관찰되는 경우, 실란-PEG-mal을 비기능성 실란-PEG와 혼합하면 앵커링 포인트의 수를 줄일 수 있다. 상이한 질량(즉, 윤곽 길이)을 가진 패시베이션 층 PEG의 조정을 위해^27을사용할 수 있다.
   2. 60 °C^35에서3 시간 동안 실란 -PEG 말 용액 (페트리 접시 당 최대 10 칩)에서 3.1.3 단계 직후AFM 캔틸레버 칩을 배양하십시오.
   3. 페트리 접시를 오븐에서 꺼내서 용액을 적어도 10 분 동안 식힙니다.
   4. 각 AFM 캔틸레버 칩을 조심스럽게 헹구어 보시고 자합니다. 예를 들어 용액에 담을 때 이러한 칩을 약간 기울여 공기 용매 인터페이스를 통과할 때 AFM 캔틸레버에 모세관력이 미치는 영향을 줄입니다.
      1. PEG 및 PS 폴리머의 경우 톨루엔으로 세 번 헹시다.
      2. PNiPAM 폴리머의 경우 톨루엔으로 한 번, 에탄올로 두 번 헹구어 두 번 헹구어 두 번.
   5. 제어 AFM 캔틸레버 칩으로 적어도 두 개의 AFM 캔틸레버 칩을 선택하고 3.3 단계를 건너뛰고 다음과 같이 헹구어 용매의 극성을 증가시다.
      1. PEG와 PS 폴리머의 경우 에탄올로 두 번, 초순수로 한 번 헹구어 두 번 헹구어 두 번.
      2. PNiPAM 폴리머의 경우 초순수로 두 번 헹구어 보시고 라닙시.
         참고: 제어 AFM 캔틸레버 칩은 폴리머 부착을 제외한 모든 기능화 단계를 거쳤습니다(단계 3.3). 그들은 SMFS 실험에 사용되는 기능화 공정, AFM 캔틸레버 칩 홀더 시스템, 표면 및 용매의 청결을 증명하는 역할을합니다.
3. 공유 폴리머 부착
   참고 : AFM 캔틸레버 팁이 말미미드 그룹으로 완전히 덮일 것으로 예상되지만, 말미미드가 비활성 PEGs^47로이어지는 물에서 가수 분해를 겪기 때문에 단일 프로브 폴리머에 대한 결합 부위가 몇 개 있습니다. 이러한 비활성 PEG는 위에서 설명한 대로 패시베이션 계층역할을 합니다.
   1. 3mL 페트리 접시에 다음 중합체 용액 중 하나에서 3.2.5 단계 직후 AFM 캔틸레버 칩을 인큐베이션합니다. 각각의 중합체가 제대로 용해되지 않으면 40°C 수조를 사용하고 용액을 잘 저어줍니다.
      참고: 티올 종단 폴리머의 사용은 실란-PEG-말의 말미미드 그룹과의 반응을 방해하는 이황화 결합의 형성으로 이어질 수 있으므로, 특히 3.3단계가 수용성^{중합체(33)에}대한 수성 완충제에 적용되는 경우 환원제가 권장된다.
      1. PEG 및 PS 폴리머의 경우, 60°C에서 1시간 동안 톨루엔에서 1.25 mg/mL의 농도를 사용하십시오.
      2. PNiPAM 폴리머의 경우 RT에서 3시간 동안 에탄올에 1.25 mg/mL의 농도를 사용하십시오.
         참고: SMFS 실험에서 다중 프로브 폴리머의 결합이 관찰되면 중합체의 농도를 감소시켜야 합니다.
   2. 각 AFM 캔틸레버 칩을 조심스럽게 헹구어 보시고 자합니다.
      1. PEG와 PS 폴리머의 경우 톨루엔으로 두 번, 에탄올로 두 번, 10분 간 식힌 후 초순수로 한 번 헹구세요.
      2. PNiPAM 폴리머의 경우 에탄올로 두 번, 초순수로 두 번 헹구어 두 번 헹구어 두 번.
   3. 실험에서 사용할 때까지 각 AFM 캔틸레버 칩을 4°C에서 초순수로 채워진 작은(1 mL) 페트리 접시에 따로 보관합니다.

4. 표면 준비

1. 실리콘 산화물 웨이퍼
   참고: 이 표면은 PEG 및 PNiPAM이 있는 SMFS에 사용되었습니다.
   1. 다이아몬드 나이프를 사용하여 작은 조각으로 실리콘 산화물 웨이퍼를 잘라.
   2. 실리콘 산화물 조각을 마이크로 원심 분리 튜브에 별도로 넣고 이 튜브를 에탄올로 채웁니다.
   3. 10 분 동안 실리콘 산화물 조각을 초음파 처리합니다.
   4. 에탄올로 산화실리콘 조각을 두 번 헹구고 질소 흐름 하에서 조심스럽게 건조시면 됩니다. 즉시 산화 실리콘 조각을 사용합니다.
2. 금에 소수성 알카네 티올의 자체 조립 단층 (SAM)
   참고: 이 표면은 PS를 사용하는 SMFS에 사용되었습니다. ^SAM에대한 자세한 내용은 문헌³⁹,^49를 참조하십시오.
   1. 금 코팅 실리콘 웨이퍼(A[100], 5nm 티타늄, 100 nm 골드)를 사용하여 4.1 – 4.1.4 단계를 수행합니다.
   2. 표면 조각을 1-도칸티올 용액(2 mM)에서 18시간 동안 배양한다.
   3. 갓 준비한 SAM을 에탄올로 두 번 헹구는다.
   4. 직접 사용하기 위해 질소 흐름이 있는 건조 된 SAM또는 나중에 사용하기 위해 최대 4 일 동안 에탄올에 보관하십시오.

5. 데이터 수집

참고: 여기에 표시된 모든 측정은 온도 변화에 대한 가열 및 냉각 샘플 단계를 사용하여 Cypher ES AFM을 사용하여 초순수에서 수행되었습니다. 일반적으로 액체를 측정할 수 있는 기능을 제공하는 모든 AfM을 사용할 수 있습니다.

1. 기능화된 AFM 캔틸레버 칩을 AFM에 삽입합니다.
2. 액체에서 측정에 적합한 샘플 홀더에 준비된 표면을 접착제(예: 고분해능 복제 화합물 101RF 또는 UV 경화 접착제).
   참고 : 이러한 접착제는 매우 불활성이며 많은 극성 용매에 내성이 있습니다. 비극성 용매(예: 톨루엔 또는 헥산)에 대한 접착제의 저항은 사용하기 전에 확인해야 합니다.
3. AFM 캔틸레버 칩과 프로브 샘플을 액체에 담그세요: 초순수.
   참고: 용매 드롭(약 100 μL)을 AFM 캔틸레버 칩 홀더에 증착할 수 있습니다. 용매로 AFM 캔틸레버 칩을 덮으면 모세관력이 감소하며, 이는 공기 용매 인터페이스를 통과하는 샘플 표면에 접근할 때 AFM 캔틸레버에서 작용합니다.
4. 필요한 경우 온도를 조정하고 시스템이 평형화하도록 하십시오.
   참고: 온도 변화는 알루미늄이나 금과 같은 반사 코팅이 있는 AFM 캔틸레버의 바이메탈 효과로 인해 AFM 캔틸레버의 편향이 발생할 수 있습니다. 평형은 편향 신호의 추가 변화가 관찰되지 않을 때까지 표면(수 μm)에서 멀리 수행되어야 합니다(MLCT-Bio-DC의 경우 최대 15분).
5. 기능화의 노화의 영향을 배제하기 위해 임의로 온도를 변화시다. 적용된 온도가 AFM 캔틸레버의 돌이킬 수 없는 굽힘으로 이어지지 않도록 하십시오.
   참고: 용매 특성에 대한 온도 영향(예: 증발 또는 점도 변화)은 실험을 방해할 수 있습니다. 제시된 예에서, 온도는 용매로서 물을 취하는 10 K의 단계에서 최대 40 K의 범위에 걸쳐 변화하였다(예를 들어, 278 K로부터 318 K).
6. 단단한 표면(예: 실리콘 산화물)에서 힘 연장 곡선을 취하여 InvOLS(역 광학 레버 감도)를 결정하기 위해 표면에 접근합니다. 이를 위해 광검출기(V) 대 압전 거리의 편향 신호를 취하고 선형 함수를 사용하여 AFM 캔틸레버 팁의 들여쓰기를 나타내는 부품의 기울기를 기본 표면(반발 정권)으로 결정합니다. 오류를 줄이기 위해 평균 5개 이상의 값을 사용하여 최종 InvOLS 값을 가져옵니다. 자세한 내용은 문헌^4,,39를참조하십시오.
   참고: InvOLS는 단단한 표면에서만 안정적으로 판단할 수 있습니다. 부드러운 표면이나 인터페이스에 대한 실험의 경우 부드러운 표면 가까이에 단단한 표면을 배치해야 합니다. 그런 다음 AFM 설정을 분해할 필요 없이 소프트 표면 실험 전후에 InvOLS 교정을 수행할 수 있습니다.
7. 스프링 상수 판정의 경우 AFM 캔틸레버 팁과 표면(여러 μm) 사이의 매력적이거나 반발적인 상호 작용이 없는 높이로 AFM 캔틸레버를 이동합니다. 그런 다음 전력 스펙트럼 밀도(PSD) 대 주파수가 플롯되는 열 노이즈 스펙트럼을 기록합니다. 다음 단계는 일반적으로 상용 AFM 소프트웨어의 자동화된 내장 기능에 의해 수행됩니다: 첫째, 획득한 열 노이즈 스펙트럼은 PSD(예: 간단한 고조파 발진기)에 함수를 피팅하여 분석됩니다. 피팅은 첫 번째 와 두 번째 공진 사이의 최소까지 수행됩니다. 둘째, PSD 대 주파수 플롯의 피팅된 부분 아래의 영역은 수직 방향으로 AFM 캔틸레버의 평균 제곱 변위를 나타내는 것으로 결정된다. 마지막으로, equipartition 정리는 AFM 캔틸레버 힘 상수^28,,50을얻기 위해 사용된다.
   참고: AFM 캔틸레버의 제1 공진 피크를 포함하는 적절한 주파수 범위를 사용해야 한다. 만족스러운 신호 대 잡음 비를 얻으려면 가능한 가장 높은 주파수 분해능으로 최소 10개의 PSD를 축적해야 합니다.
8. 실험을 시작합니다. 그리드와 같은 방식으로 힘 연장 곡선을 사용하여 힘 맵을 기록합니다(예: 20 x 20 μm^2의영역에 대해 10 x 10포인트) 로컬 표면 효과(예: 불순물, 전위)를 피하고 서로 다른 표면적을 평균화합니다.
   참고: 일반적인 파라미터는 1 μm/s의 당기는 속도와 충분한 해상도를 보장하기 위해 5kHz의 샘플링 속도입니다. 끌어당기는 속도가 변할 때 샘플링 속도를 조정해야 합니다. 후퇴 거리는 측정된 폴리머의 윤곽 또는 탈착 길이에 맞게 조정되어야 합니다(예상 길이의 약 2배).
9. 단일 중합체가 표면에 부착될 수 있도록 표면을 향한 거주 시간을 사용하고 변화시다(일반적으로 0 – 5s).
10. 시스템의 일관성과 안정성을 확인하기 위해 실험이 끝날 때 InvOLS 및 스프링 상수의 결정을 반복합니다.
    참고: 폴리머와 표면 간의 강한 접착력의 경우, 기능화를 유지하기 위해 실제 실험 후에 교정을 수행할 수 있습니다.

6. 데이터 평가

참고: 데이터 평가를 위해 Igor Pro를 기반으로 한 맞춤형 소프트웨어가 다음 단계를 수행하는 데 사용되었습니다.

1. 원시 편향 신호(볼트)를 기록된 InvOLS 및 결정된 스프링 상수와 곱하여 힘 값(뉴턴)으로 변환합니다.
2. 진정한 확장(tip-surface 거리)을 얻기 위해 수직 방향으로 압전 요소에 의해 구동되는 거리에서 AFM 캔틸레버(InvOLS와 원시 편향 신호를 곱한 후)의 편향을^뺍니다.4.
3. 마지막 이벤트 후 기준선에 선형 함수를 장착하고 힘 확장 곡선에서 동일한 값을 빼서 드리프트에 대해 얻은 힘 확장 곡선을 수정합니다. 장착된 부품은 AFM 캔틸레버 팁과 기본 표면 간에 매력적이거나 반발적인 상호 작용이 관찰되지 않는 표면에서 충분한 확장을 나타내야 합니다. 그런 다음 기준선이 0축으로 설정됩니다.
   참고: 금과 같이 반사율이 높은 표면에서 측정하는 경우 간섭이 나타날 수 있습니다. 이는 표면과 AFM 캔틸레버 의 뒷면에서 레이저 빔의 부분 반사에서 발생합니다. 따라서, 얻어진 힘 연장 곡선은 수직 확장을 따라 정현파 힘 신호 아티팩트를 나타낼 수 있다. 이것은 최종 힘 값을 방해하는 아티팩트입니다. 이러한 힘 확장 곡선을 여전히 고려하기 위해 보정이가능합니다(그림 2).
4. 간섭이 힘 연장 곡선에 나타나는 경우, 비특이적 접착력과 동일한 정현파 아티팩트(즉, 진폭 및 위상)의 피크(즉, 진폭 및 위상)를 제외한 다른 이벤트가 없는 대표적인 힘 연장 곡선(후퇴 곡선)을 선택합니다(그림2A).
   참고: 간섭의 저주파 패턴을 얻기 위해 대표적인 힘 연장 곡선을 부드럽게 합니다.
5. 수정할 힘 확장 곡선을 선택합니다(그림2B).
6. 6.4단계에서 두 힘 확장 곡선을 오버레이합니다. 및 6.5. 둘 다 동일한 정현파 아티팩트(즉, 진폭 및 위상)를 표시하도록합니다(그림 2C).
7. 부동 연진 기준선이 아닌 직선으로 이어지는 힘 연장 곡선에서 (스무딩된) 대표 힘 연장 곡선을 뺍니다(그림2D).
   참고: 대표적인 곡선의 비특이적 접착 피크는 수정할 곡선에 나타나는 단일 분자 이벤트와 구별됩니다. 사실, 대표 곡선의 선택은 적절한 수정을 위해 중요합니다.

다음 의 예는 중합체 PEG, PNiPAM 및 PS의 단일 분자 스트레칭 및 탈착의 결과를 나타낸다. 모든 AFM 캔틸레버 팁은 위에 제공된 프로토콜로 기능화되었습니다. PEG 및 PNiPAM은 온도 변화와 함께 SiOx에서 측정되었다. PEG 및 PNiPAM에 대한 생성 된 온도 의존 스트레칭 곡선에 대한 자세한 논의를 위해, Kolberg 등18 다른 힘 확장 모티프는 일정한 힘의 고원입니다 (예를 들어, 메틸의 자체 조립 단층에서 PS를 탈지 할 때 물4,,27,,39,,51)에알카네 티올을 종료하였다.

실시예 1: 물 속에서 PEG 및 PNiPAM 스트레칭
물에서의 온도 의존적 연신 거동은 한쪽 끝에 AFM 캔틸레버 팁에 공유결합된 단일 PNiPAM 및 PEG 폴리머를 사용하여 측정하고 다른 쪽 끝에 있는 SiOx 표면에 물리를 묻히게 되었다. 캘리브레이션 및 클린 컨트롤 실험(힘 확장 곡선의 2% 미만이 단일 분자 이벤트를 표시함) 후, 각 AFM 캔틸레버에 대해 적어도 2개의 힘 맵을 기록하였다. 온도 의존적 실험은 각 온도에서 적어도 하나의 힘 맵을 기록함으로써 수행되었다. 몇 개의 스트레칭 이벤트만 나타났을 때, 각각의 AFM 캔틸레버가 폐기되고 칩의 다음 AFM 캔틸레버가 촬영되었습니다(일반적으로 MLCT-Bio-DC의 순서 C, B, D 및 E). PEG의 예시적인 데이터에 대해, 단일 스트레칭 이벤트는 500개의 측정된 힘 연장 곡선 중 95개에서 관찰되었다(19%). PNiPAM의 경우 600개의 힘 연장 곡선 중 252개에서 스트레칭 패턴(42%)이 나타났습니다. 힘 확장 곡선을 더 잘 비교하기 위해 모든 온도에 대해 단일 마스터 곡선이 생성되었습니다. 이를 위해, 형태 변동 및 용매 효과가 무시할 수 있는 500 pN 이상의 스트레이징 이벤트가 있는 곡선만52를선택했다. 최종 스트스트레칭 수는 278K에서 3, 298K에서 7, PEG의 경우 318K에서 4, 278 K에서 3, PNiPAM18의경우 318 K에서 3이었다.

마스터 커브 생성 절차는 그림 3에제공됩니다. 선택한 힘 연장곡선(그림 3A)은길이 L0(500pN의 힘에서 확장)으로 재조정되고 그림 3B를참조하십시오.0 접착 피크는 표면과 AFM 캔틸레버 팁 사이의 비특이적 접착의 큰 변화를 나타내지만 폴리머 연산 거동에 영향을 미치지 는 않습니다. 재스케일링된 힘 확장 곡선을 병합한 후 그림3C에제시된 바와 같이 이노미날 스무딩에 의해 평균화됩니다. 이를 위해 가우시안 필터는 스무딩 매개변수 2053과동일한 수준에서 파스칼의 삼각형에서 파생된 정규화된 계수로 데이터를 컨볼루싱합니다. 마지막으로, 마스터 커브는 도 3D에주어진 바와 같이 모든 온도에 대해 얻어진다. 확대는 힘 확장 동작에 대한 온도 영향이 가장 두드러지는 범위를 표시합니다.

그림 4에서PEG(A)와 PNiPAM(B)의 온도 거동을 비교한 것을 확인할 수 있습니다.AB PEG의 경우 온도가 증가하면서 연이력의 감소가 관찰되었다. 온도를 278에서 318 K로 증가시킬 때 100 pN에서 재스케일링 된 확장의 약 5 %의 증가가 관찰되었다. PNiPAM의 경우 온도에 따라 달라는 반대의 변화가 드러날 수 있습니다. 온도가 278에서 328 K로 증가했을 때 100 pN에서 재스케일링 된 확장의 약 1 %의 감소가 관찰되었다. 또한, 주어진 힘 값에 대한 곡선 아래의 영역을 결정함으로써 힘 연장 마스터 곡선으로부터 스트레칭 자유 에너지를 얻을 수 있었다. 이는 분자 역학(MD) 시뮬레이션18의도움으로 스트레칭 자유 에너지의 에너지 및 엔트로픽 기여를 추출하는 데 사용될 수 있다.

예 2: 물 속에서 SAM 표면에서 PS의 탈착
물 속에서 SAM 표면으로부터 PS의 탈착은 탈착력 및 길이를 결정하고 소수성 상호작용을 정량화하는 데 사용될 수 있다. 보정 후, 적어도 두 개의 힘 맵이 표면의 두 개의 다른 지점에 기록되었다. 폴리머 부착이 성공했을 때, 힘 연장 곡선은 특징적인 특징으로, 그림 5A 및 그림 5C를참조하여 일정한 힘의 고원을 보였다. 고원과 같은 탈착은 프로브 결합의 역학이 AFM 캔틸레버 팁(준평형)의 당기는 속도보다 훨씬 빠를 때 관찰됩니다. 고원과 같은 힘 연장 곡선의 탈착력은 힘 연장 추적54를통합하여 접착 자유 에너지를 직접 제공합니다. 그들은 액체 환경,,,2,,4,23,51,,54,55의표면에 단일 폴리머의 마찰 특성뿐만 아니라 정전기, 분산 및 소수성 상호 작용을 결정하는 데 사용되었습니다.

일정한 힘의 각 고원은 탈착력과 탈착 길이를 결정하기 위해 시그모이드 곡선을 장착한 다음 히스토그램으로 플롯되었습니다. 히스토그램은 최대 값과 표준 편차를 추출하기 위해 가우시안을 장착했다. 더 나은 개요를 위해 그림 5B 및 그림 5D에제공된 대로 탈착력과 길이 값이 분산형 플롯에 함께 표시되었습니다.

물에서 SAM에 폴리스티렌의 경우, 결정된 탈착력은 이전에 얻은 값19,,23에해당합니다. 탈착 길이가 폴리머 윤곽길이(51)와상관관계가 있는 바와 같이, 탈착 길이 분포는 기능성 단부들을 통해 AFM 캔틸레버 팁에 대한 각각의 중합체의 공유 결합의 증거로 사용될 수 있다. 따라서, 탈착 길이는 지문 역할을 한다.

AFM 캔틸레버 팁에 부착된 하나 이상의 폴리머의 경우, 고원(이산 단계)의 캐스케이드는 힘 연장곡선(56)에서관찰될 수 있다. 각 고원은 상이한 연장에서 중합체의 탈착을 나타낸다. 도 5 Figure 5C 및 도 5D에 주어진 실험은 동시에 AFM 캔틸레버 팁에 부착된 두 개의 중합체의 전형적인 사례를 보여주었다. 최종 파열을 피팅함으로써 탈착 길이에 대해 이중 모달 분포를 찾을 수 있었고 탈착력은 좁은 분포를 보였습니다. 이 경우, 더 작은 탈착 길이는 도 5C에제시된 바와 같이 단일 고원 또는 더 긴 고원에 대한 추가 고원으로서 힘 연장 곡선의 90%에서 발견될 수 있다. 더 높은 탈착 길이는 얻어진 힘 연장 곡선의 37%에서 발견되었다. 따라서, 탈착 길이 분포는 AFM 캔틸레버 팁에 부착된 상이한 중합체의 수를 결정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 탈착 길이 값의 좁은 분포는 하나 및 동일한 단일 중합체가 얻어진 힘 연장 곡선에서 조사되었다는 좋은 표시이다. 동시에, 각각의 힘-확장의 중첩은 하나 및 동일한 단일 중합체가 측정되었는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.

단일 PS 폴리머의 공유 결합을 입증한 후, 이 PS 폴리머를 위한 추가 실험은 다양한 기판(고체 표면뿐만 아니라 폴리머 필름), 용매 조건, 온도, 당기는 속도 또는 거주 시간을 수행할 수 있다.

그림 1: 팁 기능화 프로세스의 회로도 개요입니다. AFM 캔틸레버 팁의 화학적 변형을 포함(1)플라즈마 활성화(2)실란화/PEGylation 및(3)폴리머 부착. 또한, 사용되는 폴리머, 즉 PEG, PNiPAM 및 PS의 상세한 화학 구조가 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 힘 확장 곡선의 간섭 제거. (A)확장을 따라 정현파 힘 신호 아티팩트를 나타내는 힘 확장 곡선을 찾았지만 단일 분자 스트레칭 이벤트가 없습니다. (B)단일 분자 이벤트가 있는 힘 확장 곡선을 선택하고, 이는 정현파 아티팩트로부터 수정되어야 한다. (C)곡선의 정현파 아티팩트가 실제로 일치하는지 제어하기 위해 곡선을 중첩합니다. (D)(B)에서힘 연장 곡선(A)을빼면 직선 기준선이있는 힘 연장 곡선이 얻어진다. 추가 해석에는 접착 피크를 사용할 수 없지만, 힘 연장 곡선은 이제 단일 분자 이벤트 영역에서 훨씬 더 정확한 힘 값으로 이어지는 아티팩트에 대해 보정됩니다(여기: > 0.2 μm 의 확장). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 298K에서 PEG의 힘 연장 곡선에서 마스터 커브의 결정. (A)7개의 힘 연장 곡선을 사용하여 298K에서 실험 데이터를 사용합니다. 500pN(B)의힘에서 길이L0으로 재스케일링한 후, 힘 연장 곡선은 마스터 커브(C)를 획득하는C바이노미날 스무딩에 의해 병합및 평균화될 수 있다. L 재배선 커브는 점으로 지정되고 마스터 커브는 실선으로 표시됩니다. 마지막으로, 상이한 온도에 대해 얻어진 마스터커브(D)를비교할 수 있다. 확대/축소는 힘 확장 동작에 대한 온도 영향이 가장 두드러지는 범위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: PNiPAM 및 PEG의 온도 의존마스터 곡선비교. PEG의 경우온도(A)를증가시킬 때 100 pN(mid-force range)에서 재스케일링 된 확장의 증가가 관찰되고, PNiPAM의 경우 반대 온도 의존적 변화가 드러난다(B).B 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 물 속에서 SAM에 대한 PS의 힘 연장 곡선 분석. (A)고원의 시그모이달 핏(보라색)을 가진 예시적인 힘 연장 곡선(파란색). 또한 화살표는 고원의 결정된 힘(빨간색)과 길이(녹색)를 표시합니다. sigmoidal 맞춤에 의해 얻어진 탈착력 및 탈착 길이 값이 분산도표에 표시되고 그 결과 히스토그램에는 가우시안이 장착됩니다. (b)결정된 평균 탈착력 및 탈착 길이 값은 (112±6) pN 및 (659±7) nm이며, 여기서 힘 연장 곡선의 93%는 이러한 단일 고원 이벤트를 나타낸다. (C)AFM 캔틸레버 팁에 부착된 2개의 폴리머에 대해 동시에 포스-익스텐션 커브(파란색)를 예로 들 수 있다. 여기서, 탈착력은 (117±5) pN의 평균 힘 값을 가진 단모달 분포를 나타내고, 이중모달 분포는 탈착 길이(656±9) nm 및 (1050±16) nm의 평균 길이 값을 이월하는 동안 발견될 수 있다. (D)샘플링된 힘 연장 곡선의 90%는 단일 고원 이벤트만 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 그들이 경쟁 금전적 이익이 없다고 선언합니다.