레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.
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방법 논문
종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해
이 논문에서
요약
초록
글리오마는 그들의 침략성과 이질성을 특징으로 하는 1 차적인 뇌종양입니다. 의사 팔리세이드, 미세 혈관 증식, 중간엽 변형 및 괴사와 같은 특정 조직학적 패턴은 고급 신경교종의 조직학적 이질성을 특징으로합니다. 우리의 실험실은 온코 스트림이라는 이름의 중간 엽 세포의 높은 밀도의 존재가 종양 악성 종양과 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 우리는 신경교종의 성장과 침략의 기초가 되는 기계장치를 이해하기 위하여 독특한 접근을 개발했습니다. 여기서, 우리는 레이저 포획 미세 내부(LMD) 및 RNA 염기서열 분석을 활용하여 종양 내 이기종 다세포 구조(즉, 중간엽 영역 또는 종양 침윤 영역)의 미분 mRNA 발현을 분석하는 포괄적인 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 좋은 조직 조직학 및 RNA 무결성을 유지합니다. 관류, 동결, 임베딩, 단면화 및 염색은 형태를 보존하고 고품질 레이저 미세 해부 샘플을 얻기 위해 최적화되었습니다. 결과는 30% 자당을 사용하여 신경교종 베어링 마우스의 관류가 좋은 형태와 RNA 질을 제공한다는 것을 표시합니다. 또한, 4% 크레실 바이올렛과 0.5% 에오신으로 종양 섹션을 염색하면 RNA 무결성을 유지하면서 좋은 핵 및 세포 염색을 초래합니다. 기재된 방법은 민감하고 매우 재현성이 있으며 다양한 종양 모델에서 종양 형태를 연구하는 데 활용될 수 있다. 요약하면, 우리는 고형 종양 내의 이기종 다세포 구조의 분자 특징을 연구하기 위해 시퀀싱을 위한 형태학 및 RNA 품질을 보존하는 LMD를 수행하는 완전한 방법을 설명합니다.
서론
신경교종은 중추 신경계의 가장 공격적인 원발성 종양입니다. 그들은 매우 침략적이고 이질적인1. 종양의 세포 및 분자 분대의 분석은 새로운 치료 표적을 드러낼 것입니다.
현재 이용 가능한 다른 방법 들 중에서, 동결 된 뇌 종양 조직의 레이저 캡처 미세 해부 (LMD)는 종양 조직에서 이산 해부학 영역 또는 특정 세포 집단을 분리하여 분자 프로필을 연구 할 수있는 비용 효과적이고 신뢰할 수있는 기술입니다2,,3. LMD는 선택된 단일 세포 또는 다세포구조의mRNA 유전자 발현 프로파일의 분석을4,5. LMD는 종양 진행 도중 일어나는 분자 사건에 관하여 심층적인 기계론적인 지식을 얻기 위하여 이용될 수 있습니다. 종양 조직의 처리개선은 조직 형태와 RNA 품질6의최적의 광학 적 분해능을 얻기 위해 필요하다. 파라포름알데히드 고정이 형태학적 분석을 위한 최선의 선택이지만, RNA 품질은 이러한 조건하에서 영향을 받고 저하되어 RNA-seq 분석을 위한 R....
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프로토콜
실험 동물을 사용하는 여기에 설명된 모든 방법은 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: GEMM 또는 안정된 선으로부터 생성된 신경구는 마우스10에서 두개내 종양 생착에 사용될 수 있고 LMD 및 RNA 시퀀싱을 위해 처리될 수 있다. 이러한 세포는 반딧불 루시퍼라아제 및 GFP 단백질을 구성적으로 표현하며, 이는 종양 성장 분석 및 국소화를 위해 더욱 활용될 것이다.
1. 유전자 조작 된 신경교종 모델에서 파생 된 신경구에서 두개내 마우스 신경교종 모델 생성
- 유전자 조작 마우스(GEMM) 모델으로부터 신경구 세포의 1차 배양을 생성하려면, 앞서 설명한 프로토콜 을 사용하여10,,11.
- 설명된 대로 신경구 배양 배지를 준비하십시오: 500 mL의 덜베코의 변형된 독수리 배지 F-12(DMEM/F12)는 50x B-27의 10 mL및 100x N-2 신경 배양 보충제의 5 mL, 100x 항생제 항균제 의 5 mL 및 1 mL의 보충. 신경구를 도금하기 전에, 배....
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결과
우리의 실험실은 수면 미용 트랜스포사아제 시스템을 사용하여 유전자 조작 마우스 모델(GEMMs)을 생성하였다(그림1A). 이 시스템은 신생아 마우스에 있는 신경 전구 세포의 게놈으로 특정 유전 변경을 통합합니다. 이 변경된 전구 세포는 내인성 신경교종 종양을 형성합니다. 종양을 생성하는 데 사용되는 플라스미드 서열은 다음과 하였다: (1) pT2C-LucPGK-SB100X 슬리핑 뷰티 트랜스포슨 및 루시퍼라제 발현, (2) NRAS 발현을 위한 pT2-NRASSV12, (3) pT2-shp53-GFP4 p53 녹아웃 및 GFP 단백질 발현, 및 (4) ATRX 노크다운을 위한 pT2-shATRx-GFP4. 플라스미드는 앞서11일설명한 바와 같이 1일된 신생아 새끼의 측면 심실에 주입되었다. 플라스미드 섭취량 및 종양 형성은 생체 내 생물 발광 이.......
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토론
신경교종 이질성 및 침략의 근본적인 분자 기전을 이해하는 것은 새로운 치료표적13을밝히는 것이 매우 중요하다. 이 원고에서는 레이저 포획 미세 해부(LMD)를 이용한 신경교종 이질성 및 침범의 분자 경관을 분석하고 전사성 분석을 통해 보다 자세하고 최적화된 방법을 설명합니다.
레이저 포획 미세해부(LMD)는 종양 내의 상이한 영역 또는 단일 세포를 식별하는데 사용될 수 있으며,종양(14)의공간 적 맥락을 유지하는 분자 패턴을 추가로 분석하기 위해 특정 샘플을 제공한다. 이러한 기술은 고형종양에서공간 전사체를 분석하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 신뢰할 수 있고 저렴한 가격(15)이다. 우리는 LMD를 사용하여 유전자 조작 마우스 종양 모형 또는 두개내 이식형 모형에 있는 신경교종 이질성 및 침략을 분석했습니다. 이 모형은 신경교종 이질성 및 침략의 연.......
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공개 사항
이 백서의 모든 저자는 잠재적 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
작업은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, (NIH / NINDS) 보조금: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 M.G.C.; (NIH/닌드) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311을 P.R.L.에 부여합니다. (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; 미시간 대학의 로겔 암 센터, 채드터프 재단, 레아의 해피 하트 재단에서 M.G.C. 및 P.R.L. RNA 생물 의학 그랜트 F046166에 신경 외과의 학과, UL1 TR002240 미시간 임상 및 건강 연구 (MICHR), 연구 및 건강 연구 (MICHR) 프로젝트 F049768 미시간 포브스 암 연구소의 A.C. 대학, 실명을 방지하기 위해 연구에서 의사 - 과학자 상, Inc., Inc.,(RPB), NIH의 NEI에서 R01 EY022633을 부여 (AK), 및 안과 및 시각 과학의 부서에 RPB에서 무제한 보조금. 이 연구는 비전 연구 코어 (P30 EY007003) 및 암 센터 연구 코어 (P30 CA046592)를 활용했습니다. AK는 A. 알프레드 타우브만 의학 연구소에서 부인 윌리엄 데이비슨 신흥 학자 상에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase 세포 박리 용액 | Biolegend | 423201 | |
| 동물 무첨가 재조합 인간 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 항생제-항진균제(100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 보충제(50X), 무혈청 | Gibco | 17504044 | |
| 완충액 RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR 튜브 | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 보충제 (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - 항균 시약 | Invivogen | ant-nr-1 | |
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| PEN 막 유리 슬라이드 (2 µ m) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint 솔루션 | Zymo Research | D3001-1 | |
| 재조합 인간 FGF - 기본 | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| 연구 저온 유지 장치 Leica | CM3050s | ||
| RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션 | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. 컴 | 파운드 Fisher Scientific | 23-730-571 |
참고문헌
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdisse....
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재인쇄 및 허가
