이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

10.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61143

⸱

2020년 6월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, 4PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

초록

소뇌는 균형과 모터 조정의 유지 보수에 중요한 역할을하며, 다른 소뇌 뉴런의 기능적 결함은 소뇌 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 질병 관련 신경 표현형에 대한 현재 지식의 대부분은 질병 진행 및 발달의 이해를 어렵게 하는 사후 조직을 기반으로 합니다. 동물 모델과 불멸의 세포주 또한 신경 퇴행 성 장애에 대 한 모델로 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 완전히 인간의 질병을 되풀이하지 않습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)는 질병 모델링을위한 큰 잠재력을 가지고 있으며 재생 접근에 대한 귀중한 소스를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 환자 유래 iPSC에서 대뇌 오르가노이드의 생성은 신경 퇴행성 질환 모델링에 대한 전망을 향상. 그러나, 많은 수의 오르가노이드를 생성하는 프로토콜과 3D 배양 시스템에서 성숙한 뉴런의 높은 수율은 부족합니다. 제시된 프로토콜은 유기체가 소뇌 정체성을 취득하는 확장 가능한 일회용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의된 조건하에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드의 재현 가능하고 확장 가능한 생성을 위한 새로운 접근법입니다. 생성된 오르가노이드는 mRNA 와 단백질 수준에서 특정 마커의 발현을 특징으로 한다. 단백질의 특정 단의 분석은 오르가노이드 구조의 평가에 중요 한 다른 소뇌 세포 집단의 검출을 허용. 유기체 극저분과 오르가노이드 슬라이스의 추가 면역 염색은 특정 소뇌 세포 집단과 공간 조직의 존재를 평가하는 데 사용됩니다.

서론

인간 만능 줄기세포(PSC)의 출현은 이러한 세포가인체의대부분의 세포 계보로 분화될 수 있기 때문에 재생 의학 및 질병 모델링을 위한 우수한 도구를 나타낸다1,2. 이들의 발견 이후, 다양한 접근법을 이용한 PSC 분화는 신경퇴행성 질환3,4,,55,6등 다양한 질병을 모델링하는 것으로 보고되었다.,

최근에는 인간 뇌 구조를 닮은 PSCs로부터 파생된 3D 배양에 대한 보고가 있었습니다. 이들은 뇌 오르가노이드3,,7,,8이라고합니다. 건강하고 참을성 있는 특정 PsCs 둘 다에서 이 구조물의 생성은 인간 발달 및 신경 발달 무질서를 모델링할 귀중한 기회를 제공합니다. 그러나, 이러한 잘 조직된 대뇌 구조를 생성하는 데 사용되는 방법은 대규모 생산을 신청하기 어렵다. 오르가노이드 내부의 괴사 없이 조직 형태 발생을 재구성할 수 있을 만큼 큰 구조를 생성하기 위해 프로토콜은 정적 조건에서 초기 신경 약념에 의존하고, 하이드로겔의 캡슐화 및 동적 시스템3의후속 배양에 의존한다. 그러나, 이러한 접근은 오르가노이드 생산의 잠재적 인 확장을 제한 할 수있다. 피질, 줄무늬, 중뇌 및 척수 뉴런,9,,10,11,,12를포함한 중추 신경계의 특정 부위에 PSC 분화를 지시하기 위한 노력이 있었지만, 동적 조건에서 특정 뇌 영역의 생성은 여전히 과제입니다. 특히, 3D 구조에서 성숙한 소뇌 뉴런의 생성은 아직 설명되지 않았다. Muguruma 등은 초기 소뇌 발달을 재구성하는 배양 조건의 생성을개척하고 최근 인간 배아 줄기 세포가 제1 삼분기 소뇌7을연상시키는 편광 구조를 생성할 수 있도록 하는 프로토콜을 보고했다. 그러나, 보고된 연구에서 소뇌뉴런의 성숙은 오르가노이드의 해리, 소뇌선 선조의 분류, 및 단층 배양 시스템에서 피더 세포와 의 공동7배양을 필요로7,14,,15,,16. 따라서, 정의된 조건하에서 질병 모델링을 위한 바람직한 소뇌 유기성 의 재현 가능한 생성은 여전히 배양 및 피더 소스 가변성과 관련된 도전이다.

이 프로토콜은 3D 확장을 위한 최적의 배양 조건과 인간 PSC를 일회용 수직 휠 생체 반응기(사양에 대한 재료 표 참조)를 사용하여 소뇌 뉴런으로 효율적으로 분화하는 최적의 배양 조건을 제시합니다( 이후 생물 반응기라고 하는 재료표 참조). 생물 반응기는 U 자형 바닥과 함께 선박 내부에 더 균일한 전단 분포를 제공하는 대형 수직 임펠러가 장착되어 있어 부드럽고 균일한 혼합 및 입자 서스펜션을 허용하여 교반 속도17을줄입니다. 이 시스템을 사용하면 모양 과 크기 조절 셀 응집체를 얻을 수 있으며, 이는 보다 균일하고 효율적인 분화에 중요합니다. 더욱이, 더 많은 수의 iPSC 유래 오르가노이드가 덜 힘든 방식으로 생성될 수 있다.

일반적으로 줄기 세포에서 형성되는 3D 다세포 구조인 오르가노이드의 주요 특징은 인간 형태 발생18,,19,,20에서볼 수 있는 것과 같은 특정 모양을 형성하는 다른 세포 유형의 자체 조직이다. 따라서, 오르가노이드 형태는 분화 과정에서 평가되는 중요한 기준이다. 유기체의 극저분과 특정 항체 세트를 가진 유기성 슬라이스의 추가 면역 염색은 세포 증식, 분화, 세포 인구 정체성 및 세포 세포 집단 정체성을 분석하기 위해 분자 마커의 공간 시각화를 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하면, 면역 염색 유기성 저온 절제에 의해, 초기 효율적인 신경 약념은 분화의 7일에 의해 관찰된다. 분화 하는 동안, 소뇌 정체성을 가진 여러 세포 인구 관찰. 이 동적 시스템에서 35 일 후, 소뇌 신경 에피텔륨은 증식 선조와 유면에 위치한 후유증 뉴런의 정량층과 함께 양봉 축을 따라 구성됩니다. 성숙 과정에서, 분화의 일 35-90에서, 소뇌 뉴런의 별개의 유형은 Purkinje 세포 (칼빈딘+),과립 세포 (PAX6+/MAP2+),골기 세포 (신경그라닌+),단극성 브러시 세포 (TBR2+),깊은 소뇌 핵 프로젝션 뉴런 (TBR1+)등 볼 수 있습니다. 또한, 배지에서 90일 후에 생성된 소뇌 기관지에서 세포사멸의 미미한 양이 관찰된다.

이 시스템에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드는 다른 소뇌 뉴런으로 성숙하고 해리와 피더 공동 문화없이 최대 3 개월 동안 생존하여 질병 모델링을위한 인간 소뇌 뉴런의 원천을 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 단층 문화에서 인간 iPSC의 패시징 및 유지 보수

  1. 플레이트 준비
    1. 지하 멤브레인 매트릭스 (재료의 표참조) 4 °C에서 주식을 해동하고 60 μL 알리쿼트를 준비합니다. -20°C에서 알리쿼를 동결합니다.
    2. 6 웰 플레이트의 우물을 코팅하려면 지하 막 매트릭스의 알리쿼트 하나를 얼음 위에 해동하십시오. 해동하면 DMEM-F12의 6mL에 60 μL을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 다시 중단합니다.
    3. 희석 된 지하 멤브레인 매트릭스 용액 1 mL을 6 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 최대 1 주 동안 4 ° C에서 저장하기 전에 RT에서 적어도 1 시간 동안 배양하십시오.
  2. EDTA와 iPSC 식민지의 패싱
    1. 37°C, 습도 95%, CO 2 5% 에서 인큐베이터내 6웰 플레이트에서 단층 배양에서 iPSC를유지한다.
      참고: 이 프로토콜에서는 F002.1A.1321,인간 상피 iPSC 라인(iPSC6.2)22,그리고 상업적으로 획득한 iPS-DF6-9-9T.B(재료표 참조)의 세 가지 인간 iPSC 라인이 사용되었습니다. Table of Materials
    2. 패시징하기 전에 실온(RT)에서 저장된 플레이트(1.1단계)를 15분 동안 배양하고 mTesR1배지(표 1)를준비한다.
    3. 혈청 피펫을 사용하여 플레이트에서 용액을 흡인하고 즉시 0.5 mL의 mTeSR1 배지를 각 웰에 추가합니다.
    4. iPSC를 함유하는 우물에서 소비된 배지를 흡인하고 우물당 0.5mMEDTA의 1mL를 사용하여 한 번 세척한다.
    5. 각 웰에 0.5mM EDTA의 1mL을 추가하고 5 분 동안 RT에서 배양하십시오.
    6. EDTA를 흡인시키고 P1000 마이크로파이프를 사용하여 mTeSR1 배지를 부드럽게 추가하고 콜로니를 피펫팅하여 우물에서 세포를 제거합니다. 원문 튜브에서 세포를 수집합니다.
      참고: 3배 이상 구피 셀을 피펫하지 마십시오.
    7. 각 웰에 세포 현탁액이 1.5 mL를 첨가한 후 배지1.5mL를 포함하도록 각 웰에 1mL의 세포 현탁액(희석 1:4)을 추가합니다. 5% CO2,37°C에서 인큐베이터로 세포를 반환합니다.
    8. 75%-80%의 합류가 달성될 때 매일 소비된 매체와 통로를 3일마다 교체하십시오.

2. 생물 반응기에서 인간 iPSC의 파종

  1. mTeSR1의 단층으로 자란 인큐베이션 iPSCs는 ROCK 억제제 Y-27632(ROCKi)의 10μM로 보충하였다. 6개의 잘 조직 배양 플레이트에서 각 웰에 1mL의 보충 배지를 추가하고 37°C에서 1시간, 습도 95%, CO2 5% 배양합니다.
    참고 : ROCKi는 apoptosis23에서해리 된 iPSC를 보호하는 데 사용됩니다.
  2. 1 h의 인큐베이션 후, 각 우물에서 소비된 배지를 흡인하고 1mL로 1mL로 1mL를 잘 씻는다×.
  3. 세포 분리 배지 의 1 mL (재료의 표참조) 6 웰 플레이트의 각 우물에 넣고 세포가 부드러운 흔들림으로 우물에서 쉽게 분리 될 때까지 7 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
  4. 세포가 분리되고 단일 세포로 해리될 때까지 P1000 마이크로파이프로 세포 분리 배지를 위아래로 피펫합니다. 각 웰에 완전한 세포 배양 배지 2mL을 추가하여 효소 소화를 비활성화하고 세포를 멸균 원문 튜브에 부드럽게 피펫합니다.
  5. 210 g에서 원심분리기는 g 3분 동안 × 상체를 제거합니다.
  6. 배양 배지(즉, MTeSR1은 ROCKi의 10μM로 보충)에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 트립판 블루 염료를 사용하여 혈류계로 iPSC를 계산합니다.
  7. 종자 15 × 106 개의 단일 세포는 생물 반응기 (최대 부피 100 mL)와 60 mL의 mTeSR1은 250,000 세포 / mL의 최종 세포 밀도에서 ROCKi의 10 μM로 보충된다.
  8. 37°C, 습도 95%, CO 2 5%로 인큐베이터에 배치된 범용 베이스 유닛에 iPSC를 함유한 용기를삽입한다.
    참고: 생체 반응기 교반은 iPSC 응집을 촉진하기 위해 범용 염기 단위 제어를 27 rpm으로 설정하여 24 시간 동안 유지됩니다.

3. 소뇌 유기체에서 인간 iPSC 유래 골재의 분화 및 성숙

  1. 단일 셀 시드의 날을 0일로 정의합니다.
  2. 첫날, 혈청 피펫을 사용하여 iPSC 골재 샘플 의 1mL를 수집합니다. 시료를 수집하기 전에 멸균 흐름에 골재를 함유하는 생물 반응기로 범용 염기유닛을 배치하여 이전과 같이 동요 하에서 생물 반응기를 유지한다. 초저 부착 24 웰 플레이트에서 셀 서스펜션을 플레이트. iPSC 파생 집계가 형성되어 있는지 확인합니다.
  3. 총 40배 또는 100x배율을 사용하여 광학 현미경으로 이미지를 획득하여 총 직경을 측정합니다.
  4. FIJI 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 집계 영역을 측정합니다.
    1. "분석 |선택 메뉴 표시줄에서측정 "을 설정하고"영역"과"OK"를 클릭합니다.
    2. "파일 선택 | 메뉴 표시줄에서 "열어저장된 이미지 파일을 엽니다. 도구 표시줄에 제시된 선 선택 도구를 선택하고 이미지에 제시된 배율 막대 위에 직선을 만듭니다. "분석 | 선택 메뉴 표시줄에서 "설정규모"를 설정합니다.
    3. "알려진 거리"에서이미지의 스케일 막대의 광공을 μm에 추가합니다. "길이단위"를μm으로 정의합니다. 설정을 유지하려면"전역"을클릭하고"OK"를 클릭합니다. 도구 표시줄에서 타원형 선택 항목을 선택합니다.
    4. 각 집계에 대해 타원형 도구로 영역을 설명합니다. "분석 | 선택 측정". 골재가 대략 구형이라는 점을 고려하여 측정된 면적을 기준으로 지름을 계산합니다.
      figure-protocol-1
      골재의 영역으로 A를 가진다.
  5. 골재의 평균 직경이 100 μm인 경우, 소비된 매체의 80%를 ROCKi 없이 신선한 mTeSR1로 대체합니다. 응집체가 직경 200-250 μm에 도달하면 소비된 모든 매체를 gfCDM(표1)으로대체하여 유기체가 생물 반응기의 바닥에 정착하게 합니다.
    참고: 평균 골지 직경이 350 μm을 초과하는 경우 분화 프로토콜이 시작되지 않습니다. 단일 셀의 파싱을 반복합니다. 일반적으로, 골재가 평균 직경 100 μm에 도달하는 데 약 1 일이 걸립니다.
  6. 37°C, 습도 95%,CO25%로 인큐베이터에 배치된 범용 기재부에 골재를 함유한 바이오액터를 삽입한다.
  7. 생물 반응기 교반을 25 rpm으로 줄입니다.
  8. 2일째에는 총 지름을 평가하기 위해 3.2, 3.3 및 3.4단계를 반복합니다. FGF2(최종 농도, 50 ng/mL) 및 60 μL의 SB431542(최종 농도, 10 μM)를 gfCDM 분화 배지의 60mL에 추가합니다(표1). 바이오 반응기에서 소비된 모든 매체를 보충 된 gfCDM으로 대체하십시오. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: SB431542는 중자극성 분화를 억제하여 신경분화(24)를유도하는 데 매우 중요합니다. FGF2는신경상피조직(25)의소작을 촉진하는 데 사용된다.
  9. 5일째에는 3.2, 3.3, 3.4, 3.8단계를 반복합니다.
    참고: 분화 프로토콜 중에 집계 크기가 증가해야 합니다. 그러나 이 매개 변수가 분화의 효능에 영향을 줄 수 있기 때문에 지름은 분화가 시작될 때만 중요합니다.
  10. 7일째에는 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 희석 FGF2 및 SB431542 ~ 2/3: GfGF2의 20 μL및 SB431542 ~ 60mL의 40 μL을 gfCDM 분화 배지의 추가합니다. 바이오 반응기에서 소비된 모든 매체를 보충 된 gfCDM으로 교체하십시오. 단계 3.6을 반복하고 생물 반응기 교반을 30 rpm으로 증가시면 됩니다.
  11. 14일째에는 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 60 μL의 FGF19(최종 농도, 100 ng/mL)를 gfCDM 분화 배지의 60mL에 추가합니다. FGF19로 보충 된 gfCDM으로 생물 반응기에서 소비 된 모든 매체를 교체하십시오. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: FGF19는 중형 뇌구조(26)의편광을 촉진하는 데 사용된다.
  12. 18일째에는 3.2, 3.3, 3.4, 3.11단계를 반복합니다.
  13. 21일, 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 생체 반응기에서 소비된 모든 배지를 완전한 신경 물질배지(표 1)로대체합니다. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: 신경분유 배지는 오르가노이드7내의 신경 세포 집단을 유지하는 데 사용되는 기저 배지이다.
  14. 28일, 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 완전한 신경 물질 매체의 60 mL에 SDF1 (최종 농도, 300 ng /mL)의 180 μL을 추가합니다. SDF1로 보충된 완전한 신경 물질 매체로 생물 반응기에서 보낸 모든 매체를 교체하십시오. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: SDF1은 뚜렷한 세포층(27)의조직을 용이하게 하기 위해 사용된다.
  15. 35일째에는 3.2, 3.3, 3.4단계를 반복합니다. 생물 반응기에서 소비된 모든 매체를 완전한 BrainPhys배지(표 1)로대체합니다. 3.6 단계를 반복합니다.
    참고: BrainPhys는 신디사이저 활성뉴런(28)을지원하는 뉴런 배지이다.
  16. 3일마다 총 볼륨의 1/3을 완전한 BrainPhys 배지로 교체하여 90일째까지 분화할 수 있습니다.

4. 극저온절제 및 면역조직화학을 위한 오르가노이드 준비

  1. 면역 염색을 위한 오르가노이드 컬렉션
    1. 생물 반응기에서 15mL 원문 튜브에 서학적 파이펫을 함유한 유기체를 함유한 배지 샘플 1mL을 수집합니다.
      참고: 오르가노이드는 7일, 14일, 21일, 35일, 56, 70, 80 및 90일을 포함한 분화의 효능을 평가하기 위해 다른 시점에서 수집되어야 한다.
    2. 1× PBS의 1mL로 상체를 제거하고 한 번 씻으시면 하십시오.
      참고: 오르가노이드를 원심분리하지 마십시오. 오르가노이드가 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착하자.
    3. 상체를 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 1 mL을 추가합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 소비된 PFA를 제거하고 1× PBS의 1mL를 추가합니다.
    4. 1× PBS의 1mL에 1× PBS를 보관하여 극저온 절제를 위해 처리할 때까지 보관하십시오.
      참고: 고정 후 1주일 이상 비건구를 1x PBS에 보관하십시오.
  2. 저온절을 위한 오르가노이드 준비
    1. 저장된 오르가노이드에서 상체를 제거합니다. 15% 자당 1mL(1× PBS로 희석됨)을 넣고, 부드러운 소용돌이로 잘 섞고, 하룻밤 사이에 4°C에서 배양합니다.
    2. 15% 자당/7.5% 젤라틴(표2)의용액을 준비하고 젤라틴을 피하기 위해 준비하는 동안 37°C로 유지한다.
    3. 15% 자당 용액을 제거하고, 15% 자당/7.5%의 젤라틴을 가루노이드에 넣고 부드러운 소용돌이로 빠르게 섞습니다. 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션.
    4. 15% 자당/7.5% 젤라틴 용액을 플라스틱 용기에 최대 절반까지 추가합니다. RT에서 응고를 기다립니다.
    5. 1h 인큐베이션 후, 파스퇴르 파이펫으로 고화된 젤라틴에 오르가노이드를 함유한 자당/젤라틴 방울을 조심스럽게 놓습니다. RT에서 약 15분 동안 굳어둡니다. 거품 형성을 피하십시오.
    6. 용기가 채워지을 때까지 15% 자당/7.5%의 젤라틴을 오르가노이드 위에 놓습니다. RT에서 완전한 응고를 기다립니다.
    7. 응고 후 4 °C에서 20 분 인큐베이션하십시오.
    8. 젤라틴을 중앙에 오르가노이드가 들어 있는 큐브로 자르고 O.C.T. 화합물 한 방울로 골판지 조각에 젤라틴 큐브를 고정합니다.
    9. 500mL 컵에 250mL의 이소펜탄을 넣고 액체 질소로 적절한 용기를 채웁니다. 집게와 두꺼운 장갑을 사용하여 액체 질소 표면에 이스펜타네가 함유된 컵을 조심스럽게 놓고 이스펜타네를 -80°C로 냉각시하십시오.
    10. -80°C에 도달하면 젤라틴 큐브를 동결될 때까지 이스펜타네가 함유된 컵에 넣고 온도를 -80°C로 유지합니다. 큐브 크기에 따라 1-2분 정도 걸릴 수 있습니다.
      참고: 큐브가 균열될 수 있으므로 -80°C 이하의 온도 또는 과도한 동결 시간을 피하십시오.
    11. 냉동 시 젤라틴 큐브를 -80°C에 빠르게 보관하고 저온절이 될 때까지 보관하십시오.
  3. 오르가노이드의 냉동 절제
    1. 저온을 켜고 -25°C에서 시편(OT) 및 저온챔버(CT) 온도를 모두 정의합니다.
    2. 두 온도가 안정되면 O.C.T. 화합물을 사용하여 시편에 오르가노이드를 함유하는 젤라틴 큐브를 수정합니다.
    3. 12 μm에서 단면 두께를 정의합니다.
    4. 큐브를 자르고 접착 현미경 슬라이드에서 3-4 개의 조각을 수집합니다 (재료 표참조).
    5. 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.
  4. 오르가노이드 슬라이스의 면역 염색
    1. 최대 10개의 슬라이드를 앞뒤로 유지하면서 50mL의 예온 된 1 x PBS가있는 코클 항아리에 오르가노이드 섹션을 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
      참고: 모든 오르간성 섹션은 액체와 침수되어야 합니다.
    2. 슬라이드를 해독하기 위해 37 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.
    3. RT에서 50mL의 1× PBS로 1x를 세척: 슬라이드를 신선한 1× PBS가 들어있는 코클 링 병으로 옮기.
    4. 새로 준비된 글리신(표2)의50mL를 포함하는 코플 항아리로 슬라이드를 옮기고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
    5. 슬라이드를 0.1% 트리톤(표2)의50mL를 함유한 코플 항아리로 옮기고 RT에서 10분 동안 투과합니다.
    6. 1× PBS로 5 분 2 초 동안 씻으시면 하십시오.
    7. 1× PBS에 담근 3mm 종이로 면역 염색 접시를 준비하십시오. 슬라이스 주위에 티슈가 있는 드라이 슬라이드를 3mm 종이에 놓습니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하면 슬라이드당 ~0.5mL로 블로킹 용액(표2)으로슬라이드의 전체 표면을 덮습니다. RT에서 30분 동안 배양하십시오.
    8. 과도한 차단 용액을 제거하고 슬라이스 주위에 조직으로 슬라이드를 건조시십시오. 1차 항체의 50 μL(표3)을단면 에 걸쳐 차단용으로 희석하고 커버립으로 덮습니다. 이전에 준비된 면역 염색 접시에 슬라이스를 놓습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    9. 슬라이드를 TBST(표2)의50mL로 코플 병으로 옮기고, 커버립이 떨어지게 하고 TBST로 5분 3배 동안 세척합니다.
    10. 이차 항체의 50 μL을 단면 에 걸쳐 차단 용액에 희석시키고 커버입술로 덮습니다. 이전에 준비된 면역 염색 접시에 슬라이스를 놓습니다. 빛으로부터 보호된 RT에서 30분 동안 배양합니다.
    11. 슬라이드를 다시 코플 항아리로 옮기고 5분 3배의 TBST50mL로 세척합니다.
    12. 슬라이스 주위에 조직으로 슬라이드를 건조하고 이전에 준비 된 면역 염색 접시에 조각을 배치합니다. 파스퇴르 파이펫으로 슬라이드의 전체 표면에 0.5mL의 DAPI 솔루션을 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양하십시오.
    13. 4.4.9 단계를 반복합니다.
    14. 조심스럽게 조직으로 슬라이드를 건조. 슬라이드를 따라 드롭하여 중간 크기의 장착 량 50 μL을 추가한 다음 각 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 낮추고 거품을 피하기 위해 약간 구부립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

프로토콜은 0.1 L 생물 반응기(도1A)를사용하여 세포 응집을 촉진함으로써 시작되었다. iPSC의 단일 세포 접종은 27 rpm의 교반 속도를 가진 매체의 60 mL에서 250,000 세포/mL 시드로 수행되었다. 이는 0일로 정의되었습니다. 24시간 후, 세포는 스페로이드 모양의 골재(1일째, 도 1B)를효율적으로 형성하고, 형태는 5일째까지 잘 유지되었고, 크기가 점진적으로 증가하여 시간이 지남에 따라 골체 형태와 크기에서 높은 수준의 균질성을 입증하였다. (그림1B). 현미경 검사법에 의한 정량적 분석은 또한 1일(도1C)까지의 골재 크기의 정상적인 분포를 드러냈다. 골재 크기는 세포가 서로 다른혈통(29,,30)으로...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

신약 스크리닝 및 재생의학 적용을 위한 특정 세포 유형을 생성하는 정된 배양 조건뿐만 아니라 큰 세포 수의 필요성은 확장 가능한 배양 시스템의 개발을 주도하고 있다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 그룹은 신경 선조 및 기능성뉴런32,,33,,34의확장 가능한 생성을 보고하고, 신경 퇴행성 장애를 위한 새로운 모델의 발달에 있는 중요한 발전을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 배아 발달의 일부 중요한 사건의 회수는 여전히 부족하며, 장기간 현탁액에서 생성된 기능성 뉴런의 유지는 아직34로달성되지 않았다. 여기에 제시된 동적 3D 배양 시스템은 소뇌 정체성으로 iPSC 유래 신경 오르가노이드를 생성하고, 동적 배양에서 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 기능성 소뇌 뉴런으로 성숙을 더욱 촉진할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자 YH와 SJ는 PBS 생명 공학의 직원입니다. 저자 BL은 PBS 생명 공학, Inc.의 CEO 겸 공동 설립자입니다. 이 협력 저자는 원고에 사용되는 생물 반응기의 개발에 참여했다. 이것은 데이터와 자료 공유에 대한 저널의 모든 정책을 저자의 준수를 변경하지 않습니다. 다른 모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), 포르투갈 (UIDB/04565/2020 통해 Programa Operacional 지역 드 리스보아 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 년 T.P.S 및 PD/BD/128376/2017 - D.E.S.N.까지, FEDER(POR 리스보아 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa 포르투갈)이 공동 자금을 지원하는 프로젝트 2020) 및 FCT는 C-정밀 LISBOA-01-0145-FEDER-016394 및 CEREBEX 세대의 실조 연구 보조금 LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 기금은 또한 유럽 연합의 호라이즌2020 연구 혁신 프로그램으로부터 보조금 협정 번호 739572-재생 및 정밀 의학 H2020-2016-2017에 따라 수령되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3MM 종이WHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigma세포 분리 매체
Anti-BARHL1 항체HPA004809Atlas 항체
Anti-Calbindin D-28k 항체CB28Millipore
Anti-MAP2 항체M4403Sigma
Anti-N-Cadherin 항체610921BD Transduction
Anti-NESTIN 항체MAB1259-SPR& D
Anti-OLIG2 항체MABN50Millipore
Anti-PAX6 항체PRB-278PCovance
Anti-SOX2 항체MAB2018R& D
Anti-TBR1 항체AB2261Millipore
Anti-TBR2 항체ab183991Abcam
Anti-TUJ1 항체801213Biolegend
Apo-transferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mL줄기 세포 기술
화학적으로 정의된 지질 농축11905031ThermoFisher
Coverslips 24x60mm631-1575VWR
결정화 정제 BSA5470시그마
DAPI10236276001시그마
디부티릴 cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
소 태아 혈청A3840001
젤라틴G9391시그마
유리 코플링 항아리E94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
글리신MB014001NZY테크
햄' s F1221765029ThermoFisher
인간 에피솜 iPSC 라인A18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
인슐린91077C시그마
iPS DF6-9-9T. BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
L-Ascorbic acidA-92902Sigma
Matrigel354230Corning기저막 매트릭스
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Millipore장착 매체
mTeSR185850 -500ml줄기세포 기술
N2 보충제17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
파라포름알데히드158127Sigma
PBS-0.1 일회용 용기SKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive 기본 장치SKU: IA-UNI-B-501PBS 생명공학
재조합 인간 BDNF450-02Peprotech
재조합 인간 bFGF/FGF2100-18BPeprotech
재조합 인간 FGF19100-32Peprotech
재조합 인간 GDNF450-10Peprotech
재조합 인간 SDF1300-28APeprotech
ROCK 억제제 Y-2763272302줄기 세포 기술
SB431542S4317시그마
설탕S7903시그마
SuperFrost 현미경 슬라이드12372098ThermoFisher접착 현미경 슬라이드
Tissue-Tek O.C.T. 화합물25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1L시그마
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.015575020ThermoFisher
액 소 가죽에서 추출한 ThermoFisher

참고문헌

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232(2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.