생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
마취제는 부분적으로 시상 피질 회로에 대한 행동을 통해 의식에 영향을 미칩니다. 그러나 휘발성 마취제가 이러한 회로의 별개의 세포 및 네트워크 구성 요소에 영향을 미치는 정도는 불분명합니다. 생체 외 뇌 조각은 조사자가 복잡한 네트워크의 개별 구성 요소를 조사하고 유발 된 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과의 기저에있는 잠재적 메커니즘을 풀 수있는 수단을 제공합니다. 뇌 절편에서 잠재적인 세포 유형 및 경로 특이적 약물 효과를 분리하려면 조사자가 구심성 섬유 경로를 독립적으로 활성화하고, 겹치지 않는 세포 집단을 식별하고, 수용액의 조직에 휘발성 마취제를 적용할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에서는 생체 외 뇌 절편에서 신피질에 대한 두 개의 독립적 인 구 심성 경로에 대한 광유전 적으로 유발 된 반응을 측정하는 방법이 설명됩니다. 세포 외 반응은 분석 네트워크 활성에 대해 기록되고 표적화 된 전체 세포 패치 클램프 기록은 소마토스타틴 및 파브 알부민 양성 인터 뉴런에서 수행됩니다. 세포 및 네트워크 반응을 조절하기 위해 인공 뇌 척수액을 통한 생리학적으로 관련된 농도의 이소플루란의 전달이 설명된다.
서론
휘발성 마취제는 한 세기 이상 동안 다양한 임상 및 학술 환경에서 유비쿼터스하게 사용되어 왔습니다. 뚜렷한 종류의 마취제는 독특하고 종종 겹치지 않는 분자 표적 1,2,3을 가지고 있지만 거의 모두 무의식을 생성합니다. 그들의 행동 효과는 상당히 예측 가능하지만 마취제가 의식 상실을 유도하는 메커니즘은 거의 알려져 있지 않습니다. 마취제는 궁극적으로 피질 시상 회로에 대한 작용을 통해 의식의 수준과 내용 모두에 영향을 미쳐 피질 계층구조 4,5,6,7,8,9 전반에 걸친 정보 통합을 방해 할 수 있습니다. 보다 광범위하게는, 피질 시상 회로의 조절은 실험적으로10 또는 약리학적으로11 변화된 의식 상태에서 역할을 할 수 있으며, 또한 ....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 동물과 관련된 모든 절차는 University of Wisconsin-Madison School of Medicine 및 Public Health Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 인터뉴런 아집단에서 형광 리포터 단백질을 발현하도록 육종 마우스
- 동형 접합성, Cre 의존성 td토마토 수컷 마우스를 동형 접합 SOM-Cre 암컷 또는 동형 접합 PV-Cre 암컷 마우스와 쌍을 이룹니다.
참고: 다른 특정 뉴런 집단은 적절한 Cre 라인을 사용하여 표적화할 수 있습니다. - 진행하기 전에 이형 접합체 자손이 최소 3 주령까지 성숙하도록하십시오. 여기에 설명된 실험의 경우, 동형접합체 부모는 세포 유형-특이적 Cre 재조합 효소 및 Cre-의존성 리포터 대립유전자 둘 다에 대해 모두 이형접합체인 자손을 생성하므로 유전형 분석은 필요하지 않습니다.
2. 바이러스 구조체의 일방적 정위 주사 수행
- 기기 사용 설명서에 표시된 대로 주입 피펫용 마이크로피펫 풀러의 설정을 조정합니다(권장 설정은 표 1 참조). 유리 마이크로 피펫을 당깁니다.
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결과
프로토콜에 설명된 단계의 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 고차 피질 영역 또는 비일차 시상 핵으로부터 도착하는 피질 입력은 비일차 시각 피질(24)의 층 1에서 부분적으로 겹치는 말단 필드를 갖는다. 독립적인 시상피질 또는 피질피질 구심성 경로를 분리하기 위해 ChR2 및 eYFP 형광 리포터를 포함하는 바이러스 벡터를 Po 또는 Cg에 주입했습니다. 주사 반경 내의 세포는 바이러스 벡터를 흡수하고, 2-4주 후에, 비특이적 양이온 채널 ChR2 및 리포터를 체세포 및 돌출 축삭 모두에서 발현한다(도 2A). 관상 동맥 조각이 수집되었습니다. 적절한 필터 큐브가 결합되면 바이러스 구축물을 발현하는 축삭이 이미지화되었습니다(그림 2B). 축삭 말단을 활성화하기 위해 ChR2를 사용하면 부착 된 소마에 대한 전제 조건없이 구 .......
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토론
이 원고에서는 생체 외 뇌 절편에서 선택적으로 활성화 된 구 심성 경로에 대한 세포 내 및 세포 외 반응을 평가하기위한 프로토콜이 설명됩니다.
광유전학적 도구와 병렬 기록 체계를 사용하면 조사관이 먼 뇌 영역의 구심성 입력에 대한 지역 인구의 반응을 조사하는 동시에 표적 인터뉴런 개체군에서 동시에 기록할 수 있습니다. 광유전학 기술을 사용하면 구심성 돌출부의 축삭 말단이 세포체가 더 이상 부착되지 않더라도 보존되고 활성화될 수 있습니다. 이는 장거리 전기 연결의 보존이 더 이상 중요하지 않기 때문에 이전에 생체 외 슬라이스에 부과된 기하학적 제한을 완화합니다. 그러나 나머지 관심 연결을 보존하는 기하학적 평면에서 슬라이스를 준비하는 데 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 피라미드 세포는 피질 기둥을 따라 수직으로 배향되고, 이들 실험에서 다중채널 프로브에 의해 측정된 유도된 네트워크 활동은 가능한 한 많이 보존되어야 하는 이러한 국부적 연결을 필요로 한다. 따라.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는이 프로젝트에 대한 기술 지원 및 지침에 대해 Bryan Krause에게 감사드립니다.
이 연구는 국제 마취 연구 학회 (IMRA에서 AR), 국립 보건원 (R01 GM109086에서 MIB) 및 미국 위스콘신 주 매디슨에있는 위스콘신 대학교 의과 대학 마취학과의 지원을 받았습니다.
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재료
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참고문헌
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P.
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