뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

Summary

생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

Abstract

마취제는 부분적으로 시상 피질 회로에 대한 행동을 통해 의식에 영향을 미칩니다. 그러나 휘발성 마취제가 이러한 회로의 별개의 세포 및 네트워크 구성 요소에 영향을 미치는 정도는 불분명합니다. 생체 외 뇌 조각은 조사자가 복잡한 네트워크의 개별 구성 요소를 조사하고 유발 된 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과의 기저에있는 잠재적 메커니즘을 풀 수있는 수단을 제공합니다. 뇌 절편에서 잠재적인 세포 유형 및 경로 특이적 약물 효과를 분리하려면 조사자가 구심성 섬유 경로를 독립적으로 활성화하고, 겹치지 않는 세포 집단을 식별하고, 수용액의 조직에 휘발성 마취제를 적용할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에서는 생체 외 뇌 절편에서 신피질에 대한 두 개의 독립적 인 구 심성 경로에 대한 광유전 적으로 유발 된 반응을 측정하는 방법이 설명됩니다. 세포 외 반응은 분석 네트워크 활성에 대해 기록되고 표적화 된 전체 세포 패치 클램프 기록은 소마토스타틴 및 파브 알부민 양성 인터 뉴런에서 수행됩니다. 세포 및 네트워크 반응을 조절하기 위해 인공 뇌 척수액을 통한 생리학적으로 관련된 농도의 이소플루란의 전달이 설명된다.

Introduction

휘발성 마취제는 한 세기 이상 동안 다양한 임상 및 학술 환경에서 유비쿼터스하게 사용되어 왔습니다. 뚜렷한 종류의 마취제는 독특하고 종종 겹치지 않는 분자 표적 ^1,2,3을 가지고 있지만 거의 모두 무의식을 생성합니다. 그들의 행동 효과는 상당히 예측 가능하지만 마취제가 의식 상실을 유도하는 메커니즘은 거의 알려져 있지 않습니다. 마취제는 궁극적으로 피질 시상 회로에 대한 작용을 통해 의식의 수준과 내용 모두에 영향을 미쳐 피질 계층^구조 4,5,6,7,8,9 전반에 걸친 정보 통합을 방해 할 수 있습니다. 보다 광범위하게는, 피질 시상 회로의 조절은 실험적으로10 또는 약리학적으로¹¹ 변화된 의식 상태에서 역할을 할 수 있으며, 또한 수면12 및 의식의 병태생리학적 장애^(13,14)에 연루될 수 있다.

마취 중 의식 상실 및 복귀의 기저에 있는 메커니즘의 파악하기 어려운 것은 부분적으로 세포, 네트워크 및 시스템 수준¹⁵에서 마취제의 비선형적이고 시너지 효과가 있는 작용에 기인할 수 있습니다. 예를 들어, 이소플루란은 선택된 뇌 영역 내의 활동을 억제하고^(16,17,18), 먼 뇌 영역(19,20,21,22,23) 사이의 연결을 손상시키며^, 경로 특이적 방식으로 시냅스 반응을 감소시킨다(^24,25) . 분자에서 시스템 수준에 이르기까지 마취제의 어떤 효과가 의식 상실에 영향을 미치기에 필요하거나 충분한지는 불분명하다. 비 침습적 기술 ^19,20,26을 사용한 의식에 대한 실질적인 임상 조사 외에도 실험자는 의식 경험을 서브 서브 한 뚜렷한 세포 및 네트워크 상호 작용을 풀려고 노력하는 것이 중요합니다.

손상되지 않은 뇌에서 발견되는 복잡한 상호 작용을 단순화함으로써 생체 외 뇌 조각은 뇌의 동적 시스템의 고립 된 구성 요소를 연구 할 수있게합니다⁹. 감소된 슬라이스 준비는 국소 신경 회로의 비교적 손상되지 않은 해부학적 구조의 이점과 체외 조작의 다양성을 결합합니다. 그러나 최근까지 방법 론적 제약으로 인해 뇌 조각에서 장거리 입력의 시냅스 및 회로 특성에 대한 연구가 배제되었습니다^27,28; 코르티코시상 섬유 관의 구불구불한 경로는 전기 자극에 의해 독립적인 구심성 경로의 활성화를 거의 불가능하게 만들었습니다.

뇌 슬라이스 준비에 대한 마취제의 효과를 조사하는 것은 추가적인 과제를 제시합니다. 온전한 호흡기 및 순환계가 없으면 마취제를 목욕에 적용해야 하며 농도는 추정된 효과 부위 농도와 신중하게 일치해야 합니다. 많은 정맥 마취제의 경우 조직의 느린 평형 속도로 인해 전통적인 약리학 적 조사가 힘들어집니다^29,30. 생체 외 제제에서 휘발성 가스 마취제의 효과를 조사하는 것은 더 다루기 쉽지만 도전 과제도 제시합니다. 이들은 흡입된 분압 선량을 수성 농도로 전환시키는 것, 및 인공 뇌 척수액(³¹)을 통해 조직으로의 약물의 변형된 전달 시스템의 필요성을 포함한다.

여기에서는 연구자가 생체 외 뇌 절편으로의 약물 전달을 위해 휘발성 마취 이소플루란의 잘 문서화된 물리화학적 특성을 활용하고, 높은 시공간 해상도로 관심 피질 영역에 대한 경로 및 층별 입력을 활성화하고, 선택된 뉴런 집단에서 동시 층류 기록 및 표적 패치 클램프 기록을 수행할 수 있는 방법이 설명됩니다. 이러한 절차를 결합하여 조사자는 시냅스에서 로컬 네트워크 수준에 이르기까지 여러 관찰 가능한 전기 생리 학적 반응 특성에서 휘발성 마취제로 인한 변화를 측정 할 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜에 설명 된 동물과 관련된 모든 절차는 University of Wisconsin-Madison School of Medicine 및 Public Health Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.

1. 인터뉴런 아집단에서 형광 리포터 단백질을 발현하도록 육종 마우스

1. 동형 접합성, Cre 의존성 td토마토 수컷 마우스를 동형 접합 SOM-Cre 암컷 또는 동형 접합 PV-Cre 암컷 마우스와 쌍을 이룹니다.
   참고: 다른 특정 뉴런 집단은 적절한 Cre 라인을 사용하여 표적화할 수 있습니다.
2. 진행하기 전에 이형 접합체 자손이 최소 3 주령까지 성숙하도록하십시오. 여기에 설명된 실험의 경우, 동형접합체 부모는 세포 유형-특이적 Cre 재조합 효소 및 Cre-의존성 리포터 대립유전자 둘 다에 대해 모두 이형접합체인 자손을 생성하므로 유전형 분석은 필요하지 않습니다.

2. 바이러스 구조체의 일방적 정위 주사 수행

1. 기기 사용 설명서에 표시된 대로 주입 피펫용 마이크로피펫 풀러의 설정을 조정합니다(권장 설정은 표 1 참조). 유리 마이크로 피펫을 당깁니다.
2. 팁 직경이 약 30μm가되도록 피펫의 날카로운 끝 부분을 끊고 수 밀리미터에 걸쳐 테이퍼를 최소화하십시오.
3. 이전에 문서화 된 절차를 사용하여 주입 할 바이러스의 적절한 역가와 양을 결정하십시오. 여기에 설명된 실험에서 1.0μL(역가: 3.1-5.7TU/mL)를 일방적으로 주입하면 좋은 결과가 나왔습니다.
4. 피펫의 전체 부피를 미네랄 오일로 채우십시오. 피펫을 마이크로 주사기에 넣고 팁이 막히지 않도록 팁을 통해 소량의 미네랄 오일을 흘립니다.
5. 최소 1.0 μL의 바이러스 구조체를 프런트필합니다. 이들 실험에 사용된 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터는 AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP였다.
6. 수술 부위에 멸균 드레이프를 배치하십시오. 정위 절차를위한 도구를 소독하고 커튼 위에 놓습니다.
7. SOM-td토마토 또는 PV-td이소 플루 란 (유도 용 3 %, 유지 관리시 1.5-2 %)과 산소 혼합물을 사용하여 이형 접합 동물을 마취하십시오. 수술 내내 발가락 꼬집음으로 수술 수준을 주기적으로 확인하십시오. 동물이 10-15분마다 호흡을 모니터링하여 마취 수술 계획을 벗어나지 않도록 합니다.
8. 동물의 머리 꼭대기를 면도하십시오. 70% 이소프로필 알코올과 요오드 기반 용액을 수술 부위에 자유롭게 바르고 안과 연고를 눈 소켓에 바르면 막이 건조되지 않습니다. 국소 마취를 위해 부피바카인/리도카인(1:1 비율, 1.0mg/kg)을 수술 부위에 피하 투여합니다.
9. 동물을 정위 프레임에 맞추십시오.
10. 메스를 사용하여 두개골의 등쪽 표면을 덮는 피부의 시상축을 따라 절개하십시오. 집게를 사용하여 피부를 수축시킵니다. 필요에 따라 0.9 % 식염수로 두개골을 수화하십시오.
11. 두개골 표면에 연필로 십자가로 전방 및 측면 좌표의 교차점을 가볍게 표시하십시오. 횡단면의 적절한 좌표에 구멍을 뚫습니다 (Bregma에 대한 mm 단위, 대상 피질 (Cg) 주입의 경우 : 전방 0.2, 측면 0.3, 후방 시상 (Po) 주입의 경우 : 후방 2.25, 측면 3.4).
    알림: 표시는 파이펫의 정확한 배치를 위한 지침을 제공하기 위해 버 구멍의 경계를 넘어 확장되어야 합니다.
12. 에어 테이블을 켜고 균형을 잡으십시오.
13. Cg로의 주입을 위해 0°에서, 또는 Po에 주입을 위해 관상면에서 45°에서 입체 프레임의 전극 조작기를 재배치합니다.
14. 주사기 펌프를 전극 조작기에 부착합니다. 마이크로 시린지 펌프 컨트롤러를 시린지 펌프에 부착합니다.
15. 2.11단계에서 생성된 표시의 교차점에서 뇌 표면 근처(건드리지 않음)의 피펫 팁을 탐색합니다. 피펫을 세로축을 따라 약 1mm/s의 속도로 뇌에 0.9mm(Cg 주입) 또는 3.1mm(Po 주입)로 전진시킵니다. 계속하기 전에 10분 동안 기다리십시오.
16. 10분(100nL/분)에 걸쳐 1.0μL의 바이러스 구조체를 주입합니다. 피펫 삽입 부위에서 바이러스가 잘 관찰되면 주입 속도를 50nL/min으로 늦춥니다.
17. 주입 후 주입 피펫을 천천히 집어넣기 전에 10분 동안 기다립니다.
18. 봉합하여 두피 절개 부위를 닫고 2-5 mg / kg 멜 록시 캄을 피하 투여합니다.
19. 이소플루란을 중단하고 마취에서 출현하는 동안 동물을 모니터링합니다. 진통제의 추가 투여를 포함하여 기관의 동물 관리 및 사용위원회에서 설명한 절차에 따라 회복 할 수 있습니다.

3. 급성 뇌 절편의 준비

1. 조직을 적출하기 전에 바이러스 작제물의 발현을 위해 적어도 3주를 허용한다.
2. 슬라이스 절차 (인공 뇌척수액 슬라이스, sACSF)를 위해 1L의 인공 뇌척수액을 준비하십시오. 성분은 표 2 를 참조하십시오.
3. 슬라이싱 절차 전반에 걸쳐 가스 분산 튜브를 통해 전달되는 용해된 95% O2/5%_CO2 혼합물로 sACSF에 공급합니다.
4. 진동 블레이드 마이크로톰을 위한 얼음 냉탕을 준비하십시오. 얼음처럼 차가운 표본 스테이지를 마이크로톰에 장착하고 조직 절편을 위해 사파이어 블레이드를 제자리에 고정합니다.
5. 오른쪽 반사가 손실 될 때까지 3 % 이소 플루 란과 산소로 마우스를 마취하십시오.
6. 단두대를 사용하여 마우스를 참수하고 즉시 4°C sACSF에 머리를 담그십시오. 조직의 건강을 유지하려면 가능한 한 빨리 다음 단계를 완료하십시오.
7. 두개골 바닥에 작은 절개를하고 각 두개골 판을 부드럽게 제거하여 두개골을 엽니 다. 밑에있는 경막을 부드럽게 제거하십시오.
8. 뇌가 여전히 두개골강에있는 동안 면도날을 사용하여 소뇌를 제거하십시오. 왼쪽 반구의 시상면을 따라 정중선 바로 옆으로 두 번째 수직 절단을 만듭니다.
9. 절편을 위해 조직 블록을 준비하십시오.
   1. 두개골에서 뇌를 부드럽게 들어 올리십시오. 평평한 시상면이 아래로 향하도록 여과지 위에 뇌를 놓습니다. 필터 페이퍼를 차단 템플릿 위로 안내하고 브레인을 기본 템플릿 윤곽선에 맞춥니다(보충 그림 1).
   2. 템플릿의 선으로 표시된 대로 관상 평면에서 두 개의 평행 절단을 만듭니다. 필요한 경우 여과지를 젖게 유지하기 위해 sACSF를 약간 떨어뜨립니다.
   3. 3.8.4단계가 진행되는 동안 조직 블록을 4°C sACSF에 잠시 놓습니다.
   4. 얼음처럼 차가운 표본 단계에 소량의 슈퍼 접착제를 바르십시오.
   5. 차가운 sACSF에서 조직 블록을 들어 올리십시오. 흡수성 타월의 모서리를 사용하여 과도한 sACSF를 제거하십시오. 조직 블록의 후방 관상 동맥 평면을 표본 단계에 붙이고 뇌의 등쪽 표면이 사파이어 블레이드를 향하도록합니다.
10. 500 μm 두께의 코로나 뇌 조각을 수집합니다. 34°C sACSF의 나일론 메쉬(보충 그림 2)에 관심 있는 조각을 놓고 용기가 실온에 도달하도록 합니다.
    참고: 여기에 설명된 실험을 위해 비일차 감각 영역인 내측 이차 시각 피질(V2MM)을 연구하기 위해 브레그마 뒤쪽 약 2.25mm를 중심으로 하는 관상 절편에서 전기생리학적 기록을 수집했습니다.

4. 휘발성 이소플루란이 용해된 실험용 인공뇌척수액(eACSF) 백의 제조

1. 3.0% 이소플루란의 스톡 혼합물 300mL를 준비합니다.
   1. 밀봉된 폴리테트라플루오로에틸렌 가스 백에 ~100mL의 95% O2/5%_CO2 가스 혼합물을 20-30mL의 액체 이소플루란과 소량의 0.9% 식염수에 추가합니다. 액체상과 기체상 사이에 이소플루란의 평형을 이루기 위해 최소 30분 동안 기다리십시오.
   2. 포화 이소플루란 가스의 양을 결정하고,_Vsat, 다음 방정식을 사용하여 스톡 백에 추가합니다.
      
      여기서 P%_stock 은 스톡 가스의 목표 조성(이 경우 3%)이고, V_스톡 은 스톡 가스 백의 최종 부피이고, P 이소플루란은 실온에서_{이소플루란} 의 분압(~240mmHg), P_총 계는 대기압(~760mmHg)입니다.
   3. 계산된 양의 포화 가스를 빈 가스 백에 추가하고 백에 95% O2/5%_CO2 가스 혼합물의 부피를 채워 스톡 백의 총 부피를 300mL로 만듭니다.
2. 실험 중 슬라이스의 관류를 위해 2 L의 인공 뇌척수액을 준비하십시오 (실험 ACSF, eACSF). 성분은 표 2를 참조하십시오. 95 % O 2 / 5 % CO₂ 가스 혼합물을 용액에 용해시킨다.
3. 대조군 및 이소플루란 용액 두 봉지를 준비합니다.
   1. 빈 폴리테트라플루오로에틸렌 가스 백에 600mL eACSF 및 600mL의 95% O2/5%_CO2 가스 혼합물을 추가합니다. 이 가방에 Control이라는 레이블을 지정합니다.
   2. 다른 빈 폴리테트라플루오로에틸렌 가스 백에 300mL의 eACSF를 추가합니다. 이 가방에 이소플루란이라는 라벨을 붙입니다.
   3. 생리학적으로 관련된 평형 기체상 농도의 이소플루란을 선택하십시오. 실험은 1.3% 이소플루란에 해당하는 가스 농도를 사용하여 수행되었습니다. 마우스는 0.9 % 흡입 된 이소 플루 란에서 올바른 반사와 아마도 의식을 잃습니다.
   4. 다음 방정식을 사용하여 실온에서 등가 기체상 농도 P%(T_room)³¹을 계산합니다.
      
      여기서 P%(_Tbody)는 단계 4.3.3에서 선택한 생리학적으로 관련된 기체상 농도이고_{, T} 룸은 25°C이고,_Tbody 는 37°C이다.
   5. 다음 방정식을 사용하여 Isoflurane 용액에 추가할 스톡 가스 백, V_스톡에서 가스의 부피를 결정합니다.
      
      여기서 V_용액 은 이소플루란 백(300mL)의 eACSF 부피이고, P%(T_룸)은 식 2로부터 입력되고, λ는 이소플루란의 식염수/가스 오스트발트 분배 계수(λ = 1.2³²)이고, P%_스톡 은 스톡 가스 백의 기체상 농도(P%_스톡 = 3.0%)이다.
   6. 이소플루란 용액 백에, 단계 4.3.5에서 계산된 스톡 가스 백, V_스톡으로부터의 가스의 부피를 추가한다.
   7. 이소플루란 용액 백에 부피의 95% O2/5%_CO2 가스 혼합물을 추가하여 이소플루란 용액 백의 총 가스 부피를 300mL로 만듭니다.
4. 대조군과 이소플루란 백을 셰이커에서 최소 1시간 동안 흔들어 이소플루란 상 평형을 허용합니다.
5. 모든 데이터가 수집된 후, 마취 가스 모니터를 사용하여 백에 남아 있는 용액 위의 이소플루란의 평형 가스 농도를 측정함으로써 정확한 농도를 확인할 수 있습니다.
6. 수성 단위의 휘발성 가스의 실험 농도를 보고하면 밀리몰 농도가 온도 변화에 더 강하기 때문입니다. 다음 방정식을 사용하여 실온 기상 농도 P%(T_room)를 등가 수성 농도(C_수성, mM)³¹로 변환합니다.
   
   여기서 α는 25°C³²에서 이소플루란에 대한 식염수/가스 분젠 분배 계수입니다.

5. 다중 채널 녹화를 위한 하드웨어 및 소프트웨어 준비

1. 제조업체 지침에 따라 16채널 데이터 수집 시스템을 설정하십시오.
   참고: 여러 상용 증폭기 및 데이터 수집 시스템을 사용하여 다중 채널 녹음을 수집할 수 있습니다. 여기에 설명된 실험에서 아날로그 신호는 전극 기준 패널을 통해 두 개의 증폭기로 전달되며, 여기서 증폭(2000x) 및 필터링(0.1-10kHz)됩니다. 데이터 수집 시스템에 대한 아날로그 입력은 40kHz에서 디지털화됩니다.
2. 적절한 16채널 헤드스테이지 어댑터를 현미경 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 암 커넥터 포트가 아래쪽을 향하도록 어댑터 방향을 잡으십시오.
3. 이 마이크로 매니퓰레이터의 작동 각도를 조정하여 수평에 대해 약 70° 각도로 기록 챔버를 향해 아래쪽을 향하도록 합니다.
4. 마이크로 매니퓰레이터에 고정된 헤드스테이지 어댑터를 통해 헤드스테이지 입력을 체외 전기생리학용 16 x 1 프로브에 연결합니다.
5. 헤드스테이지 출력 커넥터를 데이터 수집 시스템에 연결합니다.
6. 데이터 수집에 적합한 소프트웨어를 설치합니다. 처음 15개의 다중 채널 프로브 접점의 입력 신호에 대응하도록 15개의 입력 채널을 구성합니다. 나머지 채널이 세포내 전극으로부터 입력을 수신하도록 구성한다.
   알림: 데이터를 수집하고 분석할 때 전극 및 어댑터 맵을 고려하여 적절한 신호가 수집된 전극 접점과 일치하는지 확인하십시오.

6. 광 자극 프로토콜의 구성

1. 광 전달 시스템을 설정하고 함께 제공되는 소프트웨어를 설치하십시오.
2. 소프트웨어를 엽니다. 트리거 소스(디지털/TTL 출력)가 광 전달 시스템에 트리거 입력 신호를 제공하고 광 전달 시스템이 470nm LED에 트리거 출력 신호를 제공하는 하드웨어 배선 구성을 선택합니다.
3. 고출력 대물 렌즈를 장착합니다. 디지털 카메라를 사용하여 광 전달 시스템과 함께 사용할 고출력 대물렌즈를 보정합니다.
4. 광 자극 프로파일의 새 프로파일 시퀀스를 생성합니다.
   1. 원하는 패턴을 만듭니다. 여기에 설명된 실험에서, 축삭 말단의 층-특이적 활성화를 허용하기 위해 직경 150 μm의 원이 사용된다.
   2. 프로파일 시퀀스를 구성하려면 원하는 수의 시행 각각에 대해 이 프로파일을 복사하여 붙여넣습니다.
   3. 조명 강도, 펄스 지속 시간 또는 펄스 번호의 파형을 포함하는 파형 목록을 만듭니다.
   4. 각 프로파일에 파형을 임의로 할당합니다. 파형이 할당된 각 프로파일은 디지털 TTL 입력의 트리거 펄스 1개 또는 시행 1회에 해당합니다.
   5. 프로파일 시퀀스를 저장합니다.
5. 데이터 수집 소프트웨어에서 새 프로토콜을 생성합니다.
   1. 시행 횟수를 방금 만든 프로파일 시퀀스의 프로파일 수와 동일하게 설정합니다.
   2. 5.6단계에서 구성한 것과 일치하는 신호 입력을 선택합니다. 단일 디지털 TTL 출력을 제공하는 프로토콜을 구성하여 디지털 트리거 전후에 적절한 시간 동안 이러한 16개 입력 채널에서 녹음합니다.

7. 생체 외 뇌 조직 슬라이스에 다중 채널 프로브 배치

1. 버블 eACSF(밀봉된 백에 들어 있지 않음)를 3-6mL/분으로 관류합니다.
2. 관심 영역이 포함된 뇌 슬라이스를 현미경 관류 챔버의 메쉬 그리드에 옮깁니다. 백금 하프가 있는 앵커( 보충 그림 3 참조).
3. 다중 채널 프로브의 말단부에있는 전극 접점 라인이 파이얼 표면에 대략 수직이되도록 메쉬 그리드를 회전시킵니다.
4. 광시야 조명 및 마이크로 매니퓰레이터의 미세 제어 하에서 다중 채널 프로브를 슬라이스 표면쪽으로 내립니다.
5. 필터 큐브 터렛을 회전하여 피질 구심성의 축삭 말단에서 발현되는 형광 리포터 단백질의 시각화를 위해 적절한 필터 큐브를 맞춥니다. 필요한 경우 슬라이스를 회전하여 프로브를보다 정확하게 파이얼 표면과 정렬하십시오.
6. x축을 따라 최종 표적 위치에서 ~200μm 짧은 슬라이스 평면 바로 위에 프로브를 배치하고 기록되는 조직 영역의 경계 외부에 하나 이상의 채널을 남겨둡니다.
7. 매니퓰레이터를 세로축을 따라 움직여 프로브를 슬라이스에 천천히 삽입합니다. 조직 손상을 최소화하려면 날카로운 끝이 조직 표면 바로 아래에 보일 정도로만 프로브를 전진시키십시오. 이렇게 하면 전극 접점이 조직과 접촉하는 동시에 조직의 손상을 최소화할 수 있습니다.

8. 패치 클램핑 표적 뉴런 및 전체 세포 구성 획득

1. eACSF 소스를 백 제어 솔루션으로 전환합니다.
2. 표적 패치 클램프 기록을 위해 형광 표지된 세포를 식별합니다.
   1. 조리개 조리개 다이어프램을 가장 작은 직경으로 제한하십시오. 저전력 대물 렌즈를 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다.
   2. 다중 채널 프로브에 인접한(겹치지 않는) 조직 영역에 빛을 집중시킵니다.
   3. 다중 채널 프로브와 대물 렌즈 사이의 접촉을 피하기 위해 주의하면서 고출력(40x 또는 60x) 수침 대물렌즈를 결합합니다.
   4. 필터 큐브 터렛을 돌려 적절한 필터 세트를 결합하여 Cre 의존성 형광 마커를 발현하는 세포의 이미징을 허용합니다.
   5. 형광 표지된 세포를 패치 클램프 기록의 대상으로 식별합니다. 대물 렌즈를 들어 올려 패치 피펫을 내릴 수 있는 충분한 공간을 만듭니다.
3. 패치 피펫(표 1 참조)에 내부 용액(표 2)을 로드하고 피펫을 전극 홀더에 장착합니다. 1mL 주사기를 사용하여 ~0.1mL 공기에 해당하는 양압을 가합니다.
4. 패치 피펫을 용액에 넣습니다. 시각적 안내에 따라 피펫 팁에 초점을 맞춥니다.
5. 앞서 입증된 단계(³³)를 사용하여 표적화된 세포로부터 전체 세포 기록을 획득한다.
6. 셀의 고유 특성에 대한 변화(예: 입력 저항, 현재 단계에 대한 활동 전위 발사 속도)를 평가하려는 경우 이러한 기록을 수행하십시오. 그렇지 않으면 아래의 축삭 자극 프로토콜로 이동하십시오.

9. 축삭 말단의 층별 광유전학적 활성화

1. x-y 평면에서 시야각을 조작하여 광 자극 프로파일을 슬라이스의 원하는 위치에 맞춥니다.
2. 광 자극 프로토콜을 로드하고 디지털 TTL 펄스를 수신하도록 광 전달 시스템을 준비합니다.
3. 축삭 말단을 광학유전학적으로 활성화하는 동시에 세포외 전위와 세포내 막 변동을 기록합니다.
4. eACSF 소스를 이소플루란 용액으로 전환하고 15분 동안 약물을 세척합니다. 필요한 경우 세척 중에 자발적인 녹음을 수집하십시오.
5. 9.2-9.3단계를 반복합니다.
6. eACSF 소스를 제어 용액으로 전환하고 20분 동안 약물을 씻어냅니다. 필요한 경우 세척 중에 자발적인 녹음을 수집하십시오.
7. 9.2-9.3단계를 반복합니다.

Results

프로토콜에 설명된 단계의 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 고차 피질 영역 또는 비일차 시상 핵으로부터 도착하는 피질 입력은 비일차 시각 피질(²⁴)의 층 1에서 부분적으로 겹치는 말단 필드를 갖는다. 독립적인 시상피질 또는 피질피질 구심성 경로를 분리하기 위해 ChR2 및 eYFP 형광 리포터를 포함하는 바이러스 벡터를 Po 또는 Cg에 주입했습니다. 주사 반경 내의 세포는 바이러스 벡터를 흡수하고, 2-4주 후에, 비특이적 양이온 채널 ChR2 및 리포터를 체세포 및 돌출 축삭 모두에서 발현한다(도 2A). 관상 동맥 조각이 수집되었습니다. 적절한 필터 큐브가 결합되면 바이러스 구축물을 발현하는 축삭이 이미지화되었습니다(그림 2B). 축삭 말단을 활성화하기 위해 ChR2를 사용하면 부착 된 소마에 대한 전제 조건없이 구 ...

Discussion

이 원고에서는 생체 외 뇌 절편에서 선택적으로 활성화 된 구 심성 경로에 대한 세포 내 및 세포 외 반응을 평가하기위한 프로토콜이 설명됩니다.

광유전학적 도구와 병렬 기록 체계를 사용하면 조사관이 먼 뇌 영역의 구심성 입력에 대한 지역 인구의 반응을 조사하는 동시에 표적 인터뉴런 개체군에서 동시에 기록할 수 있습니다. 광유전학 기술을 사용하면 구심성 돌출부의 축삭 말단이 세포체가 더 이상 부착되지 않더라도 보존되고 활성화될 수 있습니다. 이는 장거리 전기 연결의 보존이 더 이상 중요하지 않기 때문에 이전에 생체 외 슬라이스에 부과된 기하학적 제한을 완화합니다. 그러나 나머지 관심 연결을 보존하는 기하학적 평면에서 슬라이스를 준비하는 데 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 피라미드 세포는 피질 기둥을 따라 수직으로 배향되고, 이들 실험에서 다중채널 프로브에 의해 측정된 유도된 네트워크 활동은 가능한 한 많이 보존되어야 하는 이러한 국부적 연결을 필요로 한다. 따라...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5x 광시야 대물 렌즈	Olympus	MPLFLN2.5X
40x 침수 대물 렌즈	Olympus	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 혼합물	Airgas	Z02OX95R2003045
A16 프로브	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16채널 프로브
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
마취 가스 모니터(POET II)	Criticare	602-3A
ATP, 마그네슘 염	시그마 Aldrich	A9187	세포 내 솔루션
B6. Cg-Gt(ROSA):26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	잭슨 연구소	007914	Cre 의존성 td토마토 마우스
B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	The Jackson Laboratory	008069	PV-Cre 마우스
벨리 댄서 셰이커	Thomas Scientific	1210H86-TS	밀봉된 가스 백의 평형을 위해
Betadine 용액	일반 브랜드
표백제	염소화 패치 클램프 전극용	일반 브랜드
Bupivicaine
염화칼슘 (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
모세관 유리 (패치 클램프 기록)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	붕규산염, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, 길이: 90.0mm
모세관 유리(바이러스 주사)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3.5"
주니어 마이크로 매니퓰레이터 제어를 위한	주니어 마이크로 매니퓰레이터	Luigs 및 Neumann	SM8
니퓰레이터 및 이동 테이블 Luigs	및 Neumann	SM7	제어 및 이동 테이블
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	디지타이저 및 소프트웨어
E-3603 튜빙	Fisher Scientific	14171208	95% O2/5% CO2 가스 혼합물을 배양 챔버로 전달 + 패치 클램핑 중 압력 가해
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	세포 내 솔루션
ERP-27 EEG 참조/패치 패널	Neuralynx	은퇴
충전 바늘	세계 정밀 기기	50821912	패치 클램프 피펫 필링
필터 큐브 이미징 용 큐브 EYFP		Olympus U-MRFPHQ
여과지	Fisher Scientific	09801E	조직 블록 준비 중 슬라이스 템플릿
배치 화염 / 갈색 마이크로 피펫 풀러	셔터 기기	P-1000	2.5x2.5 상자 필라멘트
가스 분산 튜브	Sigma Aldrich	CLS3953312C
유리 주사기(100mL)	Sigma Aldrich	Z314390	가스 밀봉 백 충전용
글루콘산, 칼륨염(K-글루코네이트)	Dot Scientific	DSG37020	내 용액
Glucose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, 나트륨 염	시그마 Aldrich	G8877	세포 내 솔루션
헤드 스테이지 프로브 어댑터	NeuroNexus	A16-OM16	어댑터, 16 채널 프로브를 헤드 스테이지 입력에 연결,
지혈 집게 VWR	International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, 세포 내 솔루션
HS-16 헤드 스테이지	Neuralynx	퇴역
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
이소프로필 알코올(70%)	VWR International	101223-746
주니어 마이크로매니퓰레이터	Luigs and Neumann	210-100 000 0090-R	패치 클램프 전극 조작용
LED 광원 제어 모듈	Mightex	BLS-PL02_US	광유전학 광원 제어
리도카인
Lynx-8 증폭기	Neuralynx	퇴
Lynx-8 전원 공급 장치	Neuralynx	퇴
마그네슘 설페이트 (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, 텍사스 레드 필터 큐브	Chroma	49008	이미징 tdTomato 형광 리포터
Meloxicam
마이크로피펫 홀더	Fisher Scientific	NC9044962
Microsyringe pump	World Precision Instruments	UMP3-4
Mineral oil	Generic brand
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Amplifier
Nitrogen (for air table)	Airgas	NI200
나일론 메쉬	피셔 사이언티픽	501460083	납작한 백금 와이어의 말굽 위에 뻗어 있으며, 녹음 중 그 위에 슬라이스 레스트를 뻗어 있습니다
나일론, 팬티 스타킹에서 잘라낸	일반 브랜드	작은 조각, 인큐베이션 챔버에서 슬라이스 플랫폼을 만드는 일반
안과 연고	피셔 사이언티픽	NC1697520
피펫	Dot Scientific	307	백
금 와이어	VWR International	BT124000	2cm, 평평하게, 백금 하프를 만들기 위해
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	광유전학 광 전달 시스템, PolyScan2 소프트웨어와 함께 제공
칼륨(KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
인산칼륨(KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
면도날	Fisher Scientific	12-640
사파이어 블레이드(비브라톰용)	VWR International	100492-502
메스 블레이드	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Luigs 및 Neumann	380FMU
중탄산나트륨(HCO3-)	용
밀폐형 가스 백	Fisher Scientific	109236
염화나트륨(NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, 세포 내 솔루션
Ssttm2.1(cre)Zjh/J(SOM-IRES-Cre)	Jackson Laboratory	013044	SOM-Cre 마우스
입체 기구	Kopf	Model 902	이중 소형 동물
슈퍼 글루	스테이플	슬라이스	준비 중 조직 블록을 표본 단계에 고정하는
수술 드릴	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
주사기(1mL) 및 LuerLock 팁	포함 Fisher Scientific	309628	패치 클램핑 중 압력 적용을 위한
사기(1mL) 슬립 팁 WW	Grainger, Inc.	19G384	채우기 패치 클램프 피펫
주사기 필터	VWR International	66064-414
정립 현미경	올림푸스	BX51
진동 마이크로톰	Leica Biosystems	VT1000S
Wypall 타월	Fisher Scientific	19-042-427