방법 논문

슈완 세포 표현형 사양을 평가하기 위한 튜블드 세포 외 세포 매트릭스 미세 환경의 준비

DOI:

10.3791/61496

⸱

2020년 6월 2일

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

이 논문에서

요약

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이 방법론은 기판 강성, 단백질 조성 및 세포 형태와 같은 세포 외 매트릭스 큐가 슈완 세포 (SC) 표현형을 조절하는 메커니즘을 설명하는 것을 목표로합니다.

초록

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외상성 말초 신경계 (PNS) 부상은 현재 완전한 기능 적 회복을 회복하기위해 적절한 치료가 부족합니다. 슈완 세포 (SCs), PNS의 주요 신경교 세포로, 부상 다음 재생 세포 표현형으로 분화하여 PNS 재생을 촉진에 중요한 역할을한다. 그러나, SC의 차별화된 상태는 재생에 필요한 기간을 통해 유지하기 가 어렵고 주변 세포외 매트릭스(ECM)의 변화에 의해 영향을 받고 있다. 따라서 SC와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 결정하여 SC의 재생 잠재력에 대한 단서를 제공하는 것이 필수적입니다. 이를 해결하기 위해, 다른 ECM 단백질이 강성과 단백질 조성물을 조절할 수 있는 플랫폼을 제공하는 튜닝 가능한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 흡착된 전략이 만들어졌습니다. SC는 SC 표현형의 역학을 나타내는 튜닝 가능한 기판 및 중요한 세포 기능에 시드되었다. SC 단백질 발현과 세포 형태 사이의 상호 작용을 설명하기 위해 개별 마이크로접촉 인쇄 세포 패턴 이외에 SC의 다른 종자 밀도가 면역 형광 염색 및 서부 얼룩을 특징으로하고 활용되었습니다. 결과는 더 작은 퍼설리고 세포 신장의 더 높은 넓이를 가진 세포가 SC 재생 현상관 마커의 상부를 승진시켰다는 것을 보여주었습니다. 이 방법론은 SC의 ECM과 세포 기능 사이의 중요한 관계를 해명하기 시작할뿐만 아니라 말초 신경 수리에서 생체 재료의 미래 최적화에 대한 지침을 제공합니다.

서론

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말초 신경계(PNS) 부상은 환자의 삶의 질을 손상시키고 다양한 사회경제적 인자를 통해 상당한 영향을 미치게 함으로써 헬스케어의 주요 임상과제로남아 있다1,2. Schwann 세포 (SC), PNS에 있는 주요 신경교 세포로, PNS 재생을 유도하고 짧은 간격 상해에 있는 기능적인 복구에 있는 원조에 필요한 분자 및 물리적 단서를 제공합니다. 이는 SC가 골수성 또는 Remak 표현형3으로부터"수리" 세포 표현형으로 분화하는 놀라운 능력 때문입니다. 수리 SC는 여러 가지 면에서 독특한 세포 표현형입니다. 부상 후, SC는 세포 주기를 다시 입력하여 증식 속도를 증가시키고 재인교정을 용이하게하기 위해 여러 전사 적 요인의 발현을 시작합니다. c-Jun 및 p75 NTR과 같은 이러한 요인은 미엘린 기본 단백질(MBP)과 같은 골수화 SC 마커를 증가시키는 동안4,,5로조절된다. 또한, SC는 형태학을 변경하여 길어지고 서로 정렬하여 부상 부위6을가로질러 Büngner 밴드를 형성한다. 이것은 축축이 ....

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프로토콜

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1. 튜닝 셀 배양 기판 준비 및 특성화

  1. 기판 준비
    1. 10:1과 60:1 사이의 비율로 파이펫 팁을 사용하여 PDMS 베이스 엘라스토머 및 경화 제고제는 혼합물 내에서 균일하게 분산될 때까지 격렬하게 혼합한다. 거품이 사라질 때까지 진공 건조를 사용하여 거품을 제거합니다.
      참고: PDMS 중합화 하는 동안, 경화 제는 최종 폴리머 원하는 기계적 특성을 제공하기 위해 기본 엘라스토머와 교차링크. 상호 연결 비율을 조정하여 PDMS 강성을 변경할 수 있습니다.
    2. 정사각형 또는 원형 커버슬립(예: 22mm x 22mm)에 건조된 PDMS 혼합물을 떨어뜨리고 30초에 2500rpm의 스핀 코터에 커버슬립을 회전시다.
    3. 60°C에서 오븐에서 커버슬립을 1-2시간 또는 실온으로 배양하여 PDMS가 고화시화합니다.
    4. UV-오존 클리너를 사용하여 7분(UV 파장: 185nm 및 254nm)을 사용하여 커버슬립을 처리하여 표면 친성성을 높입니다. 살균 된 6 웰 접시에 넣습니다.
    5. 세포 배양을 위해 사용하기 전에, 기판을 70% 에탄올에서 적어도 30분 동안 배양한다.
      주의: UV-오존 클리너는 인간에게 유해한 오존을 생성할 수 있습니다. 화학 연기 후드 또는 환....

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결과

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SC 표현형에 대한 기판 강성과 단백질 조성간의 상호작용을 분석하고 정량화하기 위해, 튜닝 가능한 PDMS 세포 배양 기판(도1A)이개발되었다. 서로 다른 기지에서 중합체의 압축 테스트: 경화제 비율은 기판의 영의 계수(E)를 정량화하기 위해 활용되었다(도1B). 계수 값의 결과 범위는 생리학적으로 관련된 기판 조건을 나타냅니다. 기판의 준비에 따라, SC는 조정 가능한 미세 환경에서 배양 및 세포 특성을 분석했다. 다른 단백질 조성물의 기판에 대한 SC의 증식율이 먼저 분석되었다. 라미닌 코팅 기판은 콜라겐 I및 fibronectin 흡착에 비하면 10 μg/mL(도2A, B)에서모두 더 높은 증식률을 초래하였다. 라미닌 코팅 및 다른 계열이 있는 기판에 대한 SC는 상대적으로 부드러운 기판(E=3.85kPa)이 모든

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토론

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SC는 신경 손상 에 따라 그들의 표현성 변환 및 재생 잠재력으로 인해 신경 재생을 촉진할 수 있습니다. 그러나, ECM 큐가 이 재생 능력을 통제하는 방법은 신경 재생을 승진시키는 것을 목표로 하는 생체 재료의 발달뿐 아니라 신경 재생에 관련되었던 기계장치의 이해를 잠재적으로 방해하는, 주로 불분명남아 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 시작하기 위해, 세포 배양 기질은 강성, 단백질 코팅 및 접착제 지형과 같은 ECM 큐를 조절할 수 있는 곳에서 만들어졌습니다. 미세 패턴 접착 지형을 하는 기능은 마이크로컨택 인쇄의 일반적인 방법을 활용하여 프로토콜 내의 주요 기능입니다. 그러나, 이러한 기판은 PDMS 우표에 적용되는 압축력이 세포 배양 기판에 대한 셀 접착제 영역의 원하는 형상을 달성하기 위해 적절한 수준에 있어야 한다는 점에서 유리와 다르다. 형광소 세럼 알부민(fBSA)을 모델 단백질로 활용하여 세포 접착제 영역을 시각화하고 PDMS 우표에 대한 압축력을 조절하면 궁극적으로 이러한 문제를 완화할 수 있다. 유리의 .......

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공개 사항

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저자에 의해 잠재적 이해 상충이 보고되지 않았습니다.

감사의 글

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저자는 감사 신시내티 대학의 자금 지원을 인정합니다. 저자는 또한 지원을 신시내티 대학 고급 재료 특성화 연구소의 론 Flenniken 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청(BSA)의 알부민, 텍사스 레드 접합체Thermo Fisher ScientificA23017BSA 염색으로 미세패턴
표시 안티-마우스 IgG, HRP 결합 항체세포 신호 기술7076S웨스턴 블롯 분석에 사용되는 항체
안티-토끼 IgG, HRP 결합항체 세포 신호 기술7074S웨스턴 블롯 분석
에 사용되는 항체세포증식을 측정하는 데 사용되는Thermo Fisher ScientificB23151
Alexa Fluor 488과 결합된 BrdU 1차 항체Thermo Fisher ScientificB35130세포 증식 분석에서 BrdU를 시각화하는 데 사용
콜라겐 IThermo Fisher ScientificA10483-01커버슬립을 코팅하는 데 사용되는 단백질
압축력 시험기TestResources고분자의 기계적 특성을 정량화하는 기기
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11965092 Cell Culture Medium
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000044Cell Culture Medium supplemental
FibronectinThermo Fisher Scientific33010-018Protein used to coat coverslips
Fluorescence 현미경NikonEclipse Ti2형광 현미경
Halt 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일 (100X)Thermo Fisher Scientific78440프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제
라미닌Thermo Fisher Scientific23017015커버슬립 코팅에 사용되는 단백질
DAPIThermo Fisher ScientificP36971커버슬립 마운트앤트 및 핵 염색
마우스 c-Jun 1차 항체Thermo Fisher Scientific711202c-Jun 단백질을 시각화하기 위한 1차 항체
Mouse β-Actin 1차 항체세포 신호 전달 기술3700S웨스턴 블롯 실험을 위한 로딩 제어
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122세포 배양 배지 보충
포토레지스트 SU 2010KAYAKUSU8-2010포토레지스트
플루로닉 F-127시그마 알드리치P-2443블록 비특이적 단백질 결합
토끼 c-Jun 1차 항체세포 신호 기술9165Sc-Jun 단백질의 시각화를 위한 1차 항체
토끼 미엘린 염기성 단백질 1차 항체Abcamab40390시각화를 위한 1차 항체 MBP
Rabbit p75NTR 1차 항체세포 신호 전달 기술8238Sp75NTR
Rhodamine phalloidinThermo Fisher ScientificR415세포 세포골격
RIPA 완충액Abcamab156034세포 용해 완충액
RT4-D6P2T Schwann 세포주ATCCCRL-2768세포주 실험
SYLGARD 184 PDMS 염기 및 경화제Sigma Aldrich761036커버슬립 코팅에 사용되는 조정 가능한 중합체
TrypsinThermo Fisher Scientific15090-046세포 해리 시약
UV-오존 세정제NovascanPDMS의 친수성 향상
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066 세포 해리 시약
BrdU 시약 시각화를 위한 1차 항체 의 시각화

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R.

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재인쇄 및 허가

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Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

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