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방법 논문

원추 수질 절개에 의한 쥐의 배뇨근 과소 모델

1.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61576

⸱

2020년 8월 28일

 ,  ,  , 
1Department of Urology, Beijing YouAn Hospital, Capital Medical University, 2Department of Urology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 쥐에서 원추 수질 절개에 의한 배뇨근 과소 활동 모델을 확립하는 방법을 제시합니다. 배뇨근 기능 저하는이 동물들에서 성공적으로 자극되었습니다. 이 모델은 요로 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

제시된 프로토콜의 목표는 원추 수질 절개를 통해 쥐에서 배뇨근 과소 활동 (DU) 모델을 확립하는 것이 었습니다. 후궁 절제술은 체중이 200-220g 인 총 40 마리의 암컷 Wistar 쥐 (대조군 : 10 마리, 시험군 : 30 마리)에서 수행되었으며, 원추 수질은 시험군의 L4-2012L5 수준에서 형이 절제되었습니다. 모든 래트를 6주 동안 동일한 환경 조건 하에서 사육하고 먹이를 주었다. 시험군에서는 6주 동안 매일 2회 소변 배뇨를 실시하고 평균 잔뇨량을 기록하였다. 두 그룹 모두에서 방광 측정이 수행되었습니다. 최대 방광 측정 용량 (MCC), 배뇨근 개방 압력 (DOP) 및 방광의 순응도를 기록하고 계산했습니다. 시험 그룹은 척추 쇼크 동안과 후에 수술 후 상당한 요정체를 보였다. 그러나 대조군에서는 이상이 관찰되지 않았습니다. 대조군과 비교했을 때, 시험군에서 MCC 및 방광의 순응도는 시험군보다 유의하게 높았으며 (3.24 ± 2.261 mL 대 1.04 ± 0.571 mL; 0.43 ± 0.578 mL / cmH 2 O 대 0.032 ± 0.016mL / cmH 2 O), 시험군의 DOP는 대조군보다 낮았다 (20.28 ± 14.022 cmH 2 O 대 35 ± 13.258 cmH2 O). 원추 수질 절개에 의한 DU의 동물 모델을 확립하는이 방법은 DU의 병태 생리학을보다 잘 이해할 수있는 훌륭한 기회를 제공합니다.

서론

배뇨근 기능 저하 (DU)는 연구 된 전형적인 하부 요로 기능 장애입니다. DU는 국제 요실금 학회(ICS)1에 의해 정의되었지만 이 질병을 지칭하기 위해 "배뇨근 부전", "수축성 방광", "배뇨근 areflexia"2와 같은 다양한 용어가 사용됩니다. 2002 년 국제 요실금 학회 (ICS)에서 정의한 DU는 강도와 지속 시간이 감소하여 방광 비우기 시간이 장기간 증가하여 정상적인 기간 내에 방광 비우기를 완료하지 못하는 수축입니다.

DU는 하부 요로 증상이 있는 남성 (>70세)의 48%와 여성(70세)의 12%에 영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 다 인성 인 것처럼 보이며 효과적인 치료법이 없습니다. DU는 다발성 경화증4, 당뇨병5, 파킨슨 병6 또는 뇌졸증7과 같은 신경성 방광 기능 장애 환자에서 어디에나 있는 것으로 보고되었습니다. DU는 또한 복강경 자궁 적출술, 전립선 절제술 또는 작은 골반의 다른 외과 적 개입과 같은 의원 성 신경 손상에 의해 유발 될 수 있습니다8. DU의 병태생리학적 변화와 이용 가능한 치료법은 연구를 위한 적절한 동물 모델이 없기 때문에 여전히 혼란스럽습니다.

배설 반사는 폰틴 배혈 센터, 천골 부교감 신경 핵 및 더 많은 고위 피질 센터9를 결합하는 척수-구근 척추 경로에 의해 제어됩니다. 배변 반사의 활성화 및 유지는 주로 방광에서 더 높은 피질 센터로의 감각 신호의 규칙적인 수송에 달려 있습니다. 감각 기능 장애가 DU에 기여한다고 가정 할 수 있습니다.

하부 요로 기능 장애와 관련된 대부분의 실험 동물 연구는 과민성 방광(OAB) 모델10에 초점을 맞추었습니다. 이러한 모델은 OAB 병태생리학 및 예후에 대한 합리적인 이해를 제공합니다. 그러나 척수상 손상(국소 병변, 쇠퇴 및 중뇌 동맥 폐색), 척수 절개 또는 타박상 손상, 전신(예: 사이클로포스파미드) 또는 자극제 또는 염증제(예: 산, 아크롤레인 및 지질 다당류)의 방광내 투여와 같은 몇 가지 DU 모델만 보고되었습니다.11,12,13,14 . 이러한 방법 중에서, 척수 절개 또는 타박상 손상 방법만이 DU13의 동물 모델을 확립하는데 사용될 수 있다. 폰틴 배뇨 센터와 상급 피질 센터의 부상과 관련된 시도는 심각한 외상으로 인해 포기되었습니다. 따라서 최소한의 부작용으로 DU를 유도하기 위해 배합 반사 센터에서 정확한 위치를 찾는 데 더 많은 관심을 기울이고 있습니다.

앞서 언급했듯이 DU를 유도하는 메커니즘 중 하나는 척수를 손상시켜 배합 반사의 신호 경로를 손상시키는 것입니다. Allen의 체중 감소 방법은 손상된 척수15를 가진 실험실 동물을 확립하기 위해 개발되었습니다. 그러나이 방법에 대한 추가 실험 데이터는 없습니다. 더욱이, 동물의 일부가 DU없이 뇌졸중 후 척추 기능을 회복했기 때문에, DU 동물 모델16을 생성하기 위한 완벽한 방법으로서 간주될 수 없다.

1987년, Bregman은 DU 동물 모델을 생성하기 위해 척수를 횡단하는 과정을 발굴하고 실험 데이터(17)를 획득하였다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 DU 동물 모델을 확립하는데 적용되지 않았다. 그 당시 연구자들은 여전히 DU의 발병 기전에 대해 혼란 스러웠습니다. OAB 또는 DU의 유도와 관련된 척수의 위치가 서로 인접하기 때문에 DU17을 유도하는 척수 손상의 정확한 부위를 찾을 수 없었습니다. OAB 및 DU는 이 방법에 의해 함께 또는 별도로 도입되었습니다. 따라서 이 방법은 DU를 도입했지만 부정확하여 DU의 발생 및 처리를 이해하는 데 사용할 수 없었습니다.

위에서 언급했듯이 DU의 적합한 동물 모델이 없다는 것은 DU의 연구의 주요 장애물 중 하나입니다. 연구원들은 DU의 병리를 시뮬레이션할 수 있는 정확하고 관리 가능한 모델을 지속적으로 찾고 있습니다. DU에 대한 치료 옵션조차도 지난 20 년 동안 크게 개선되지 않았습니다. 총체적으로, DU의 동물 모델을 확립하기 위한 표준 프로토콜을 기술할 필요가 크다.

따라서이 논문에서는 원추 수질 절개에 의한 DU의 쥐 모델을 성공적으로 확립하는 방법을 설명합니다. 원추 수질을 분리하기 위해 L4\u2012L5 수준에서 절개를 수행했습니다. 최대 방광 측정 용량 (MCC), 배뇨근 개방 압력 (DOP) 및 방광의 순응도를 기록하고 분석하여 프로토콜을 검증했습니다. 아래에 명시된 프로토콜은 타당성과 신뢰성을 표준화된 방식으로 결합하여 DU의 발생 및 처리를 시뮬레이션하는 DU 동물 모델을 설정합니다. 이 프로토콜은 DU의 추가 연구를 위한 기술로 사용될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 랫트는 수도 의과 대학 베이징 우호 병원의 동물 실험위원회에서 승인 한 프로토콜에 따라 사용되었습니다.

1. 수술 준비, 마취 및 수술 기술

참고 : 체중이 200-220g 인 총 40 마리의 암컷 Wistar 쥐가 본 연구를 위해 상업적으로 획득되었습니다. 40마리 중 10마리를 무작위로 대조군으로 선정하고 나머지는 시험군으로 처리하였다. 모든 동물은 수도 의과 대학 베이징 우정 병원의 동물 시설에서 멸균 된 환경에 보관되었습니다.

  1. 펜토바르비탈 나트륨을 복강 내 투여하여 전신 마취를 수행합니다(40mg/kg). 또는 3%-4% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고 1%-3%(흡입)로 유지합니다. 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 용 연고를 바르십시오. 그런 다음 쥐를 수술 플랫폼에 놓고 열 지원을 제공하십시오.
    참고: 시술 시작시 부 프레 노르 핀, 0.05 mg / kg, SC, 0.1-0.2 mL와 같은 진통제를 투여하십시오.
  2. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 부족하여 마취 깊이를 확인하십시오. 면도기로 뒤쪽 전체에서 모피를 면도하십시오.
  3. 클로르헥시딘 또는 포비돈 요오드와 같은 2단계 스크럽과 이소프로필 알코올을 최소 3회 주기로 수술 부위를 소독합니다. 수술 용 테이프로 팔다리를 고정하고 수술 용 가위로 뒤쪽을 약 3cm 정도 절개하십시오.
  4. 수술 용 가위를 사용하여 피하 조직을 통해 절개를 깊게하고 척추에 부착 된 근육을 잘라냅니다.
  5. 13번째 갈비뼈를 육안으로 식별하고 노출합니다(해당 갈비 뼈에 연결된 추간 공간은 간격 T13\u2012L1). 봉합사를 사용하여 13번째 갈비뼈를 표시하십시오.
  6. 식별 후 척추에 부착 된 근육을 조심스럽게 절제하고 척추를 노출시킵니다. 척추의 정확한 식별을 위해 극상 인대와 척추 간 인대를 절제합니다. 수술용 가위와 집게로 L4\u2012L5의 레벨을 노출시킵니다.
    참고: 극상 인대는 얇은 피하 조직의 존재 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 극상 인대 절제술 후, 극 과정 사이의 인대는 척간 인대입니다.
  7. L4-u2012L5 척추 가시돌기와 횡돌기 부분을 켈리 겸자를 사용하여 척수를 노출시키는 부분을 조심스럽게 해부합니다(그림 1).
  8. L4\u2012L5 수준에서 원추 수질을 완전히 노출시키고 홍채 절제술 가위로 원추 수질을 완전히 횡단합니다. 척수의 회복을 막기 위해 조직 패킹을 삽입하십시오.
  9. 4-0 비 흡수성 봉합사를 사용하여 외부 피부층의 위에 놓인 근육과 피부를 닫습니다.
  10. 대조군의 경우 1.1-7단계를 수행하고 원추 수질을 그대로 둡니다. 1.9단계에 따라 절개 부위를 닫습니다.

2. 동물 회복

  1. 수술 후 첫 1 시간 동안 온도가 조절되는 인큐베이터 (37 ° C)에 쥐를 보관하고 흉골이 생기거나 활발하게 움직일 때까지 모니터링하십시오.
    알림: 전체 복구에는 약 30 분이 걸립니다.
  2. 충분한 음식과 물로 동물을 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 쥐를 별도의 새장에 보관하십시오.
    참고: 절편의 성공은 시험군의 쥐가 앞다리의 도움으로 만 움직이는 반면 대조군의 쥐는 정상적으로 걸을 수있을 때 나타납니다.

3. 사후 운영 관리

  1. 항생제 인 페니실린 G (동물 당 50,000 U / mL)를 복강 주사하십시오. 수술 후 48시간 동안 6-12시간마다 부프레노르핀, 0.05mg/kg, SC, 0.1-0.2mL와 같은 진통제를 투여하십시오.
  2. 배뇨를 돕기 위해 하복부의 방광을 압박하십시오. 6 주 동안 같은 시간에 매일 두 번 (오전 8시와 오후 8시) 수행하십시오.
    참고: 배뇨근의 정상적인 수축 손실은 DU의 상징입니다.
  3. 모든 쥐를 대사 케이지에 수용하고, 각각은 배뇨 및 요실금을 모니터링하기 위해 이전에 무게를 측정한 흡수성 종이 위에 놓인 소변 수집 깔때기를 포함합니다.
  4. 공극량(VV)과 잔뇨량을 별도로 나타내는 흡수지의 무게 변화를 수집하고 기록하십시오.

4. 요역동학 검사

  1. 수술 후 6 주에 다음과 같이 요 동력학 측정 장비를 사용하여 방광 조영술을 수행하십시오.
    1. 복강에 10 % 클로랄 수화물 (3 mL / kg)을 주입하여 쥐를 마취하십시오.
    2. 방광을 압축하여 배뇨시킨 다음 테이프를 사용하여 쥐를 수술 플랫폼에 고정시킵니다.
    3. 경막 외 카테터 (3F)를 방광에 삽입하고 요 역학 측정 장비, 경막 외 카테터 및 주입 펌프를 3 개의 사지 튜브로 연결합니다.
    4. 요역동학 측정을 위해 생리식염수를 0.2mL/min의 속도로 펌핑합니다( 재료 표 참조). MCC 및 DOP 및 방광의 순응도를 기록합니다 (방광 부피δ 배뇨근의 압력으로 나누어 계산δ).

5. 통계 분석

  1. 상용 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  2. 콜모고로프-스미르노프 검정을 사용하여 데이터의 정규성을 검정합니다.
  3. 정규 분포 변수를 표준 편차가 있는 평균값으로 표현합니다. 양측 쌍을 이루는 스튜던트 t-검정을 사용하여 두 그룹의 방광경 모수를 비교합니다.
    참고: p < 0.05는 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 나타냅니다.

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결과

원추 수질 절개의 전체 절차는 숙련 된 외과의가 45 분 이내에 완료 할 수 있습니다. 우리 실험실은 100 건 이상의 원추 수질 절개 수술을 수행했습니다. 성공률은 쥐의 생존과 DU의 성공적인 유도에 의해 정의 된 95 % 이상입니다. 요역동학 검사는 DU의 유도를 확인했습니다.

우리의 경험에 비추어 볼 때, DU의 유도는 잔뇨량에 의해 예비 적으로 평가 될 수 있습니다. 수술 직후 소변의 보유가 관찰되었습니다. 시험군에서는 수술 후 2일째에 부피의 피크점이 나타났고, 부피의 감소는 약 10일 동안 점진적으로 지속되었습니다. 수술 10 일 후, 볼륨은 일정한 수준에 도달했습니다 (그림 2). 수술 후 첫 10 일 동안 평균 잔뇨량은 2.09 ± 1.05mL였으며 수술 후 10일째 에는 0.67 ± 0.21mL로 감소했습니다. 그러나 대조군에서는 이상이 관찰되지 않았습니다.

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토론

DU는 남성과 여성 모두에서 하부 요로 증상의 일반적인 원인입니다. 영향을 받은 사람들의 삶의 질(Qol)을 크게 감소시킬 수 있는 치료 옵션이 거의 없는 복잡한 증상 집합체입니다18. DU는 다 인성이라고 믿어 지지만 병인에 대한 이해는 초보적입니다. 연구에 따르면 DU의 발병 기전은 근인성 및 신경성 요인과 관련이 있을 수 있습니다.

근원성 가설에서 DU를 가진 개인은 건강한 노화를 가진 사람들보다 배뇨근 수축력이 더 크게 감소할 수 있다는 것이 관찰되었습니다. 배뇨근 수축력은 나이가 들면서 감소하고 아마도 대사 또는 신경성 질환과 같은 다른 요인의 영향을 받는 것으로 밝혀졌습니다. 요역동학 평가의 데이터는 DU와 공극 후 잔류물이19세 노화와 관련이 있음을 보여주었습니다. 한 연구에 따르면 남성의 22.1%와 여성의 10.8%(모두 60세 >)가 방광 비우기...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 식염수Wuhan Prosai CompanyEY-C1178요역동학 측정용 펌프
10% 클로랄 수화물Shandong Yulong Co., LtdH370226733mL/kg, 복강내
부프레노르핀 염산염 주사투여 Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co. LTDH120202750.05mg/kg 수술 후
경막외 카테터Shandong Xinghua Co, Ltd요역동학 측정을 위한VABR3L
Penicillin GAlta Technology Co., Ltd1ST5637동물당 50,000 unit/ml
pentobarbitalBeijing solabo Technology Co., LtdNK-WF000140 mg/kg, 복강내
봉합선 투여 (4-0)ETHICONVCP422H부상
봉합삼다리 튜브Shandong Xinghua Co, Ltd요역동학 측정을 위한VAB3T
미량 주입 펌프Zhejiang Smith Medical Instrument Co., Ltd20162540335요역동학 측정을 위해 0.2ml/min의 속도로 식염수를 펌핑
요역동학 측정 장비의료 측정 시스템B.V.08-0467요역동학 측정장비는 배뇨곤란의 진단에 도움이 될 뿐만 아니라 치료 및 치료 효과를 위한 객관적인 자료를 제공할 수 있습니다. 하부 요로 기능 질환의 임상 진단 및 치료에서 가장 일반적으로 사용되는 검사 방법
Wistar RatsHFK Biotechnology Co., Ltd, 베이징, 중국SCXK2012-0023200-220g
24시간 및 48시간 피하

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