방법 논문

2차원 크로마토그래피 및 질량분석법과 결합된 16-plex Tandem Mass Tag Labeling에 의한 고처리량 및 심층 단백질체 프로파일링

DOI:

10.3791/61684

⸱

2020년 8월 18일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 것은 16-plex 탠덤 질량 태그 시약으로 개발된 최적화된 고처리량 프로토콜로, 생물학적 샘플의 정량적 단백질체 프로파일링을 가능하게 합니다. 광범위한 염기성 pH 분별 및 고분해능 LC-MS/MS는 비율 압축을 완화하고 깊은 단백질체 범위를 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

등압 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링은 높은 다중화 용량과 깊은 단백질체 적용 범위로 인해 단백질체학에 널리 사용됩니다. 최근에는 확장된 16-plex TMT 방법이 도입되어 단백질체 연구의 처리량이 더욱 증가하고 있습니다. 이 원고에서는 단백질 시료 전처리, 효소 분해, TMT 라벨링 반응, 2차원 역상 액체 크로마토그래피(LC/LC) 분획, 탠덤 질량 분석법(MS/MS) 및 컴퓨터 데이터 처리를 포함하여 16-plex TMT 기반 심층 단백질체 프로파일링을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 16-plex TMT 분석에 특화된 공정의 중요한 품질 관리 단계와 개선 사항이 강조됩니다. 이 멀티플렉스 프로세스는 세포, 조직 및 임상 표본과 같은 다양한 복잡한 샘플을 프로파일링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 최대 16개의 서로 다른 샘플에서 추출한 매우 복잡한 생물학적 샘플에서 10,000개 이상의 단백질과 인산화, 메틸화, 아세틸화 및 유비퀴틴화와 같은 번역 후 변형을 단일 실험에서 정량화할 수 있어 기초 및 임상 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질량 분석 기술의 급속한 발전으로 단백질체학 응용 분야에서 높은 감도와 깊은 단백질 커버리지를 달성할 수 있게 되었습니다 1,2. 이러한 발전에도 불구하고 시료 다중화는 대규모 시료 코호트 분석을 처리하는 연구자에게 여전히 병목 현상으로 남아 있습니다.

다중화 등원소 라벨링 기법은 대규모 시료 배치의 단백질 전체 상대 정량화에 광범위하게 사용됩니다 3,4,5,6. TMT(Tandem mass tag) 기반 정량 분석은 높은 multiplexing 기능 7,8으로 인해 널리 사용되는 선택입니다. TMT 시약은 처음에 최대 6개의 시료를 동시에 정량화할 수 있는 6-plex 키트로 출시되었습니다9. 이 기술은 10-11 샘플(10,11)을 정량화하기 위해 더욱 확장되었습니다. 최근에 개발된 16-plex TMTpro(이하 TMT16이라고 함) 시약은 단일 실험에서 16개의 샘플로 다중화 용량을 더욱 증가시켰습니다12,13. TMT16 시약은 프롤린 기반 리포터 그룹을 사용하는 반면, 11-plex TMT는 디메틸피페리딘 유래 리포터 그룹을 적용합니다. TMT11과 TMT16은 모두 동일한 아민 반응기를 사용하지만 TMT16의 질량 수지 그룹은 TMT11의 질량 수지 그룹보다 크므로 리포터 이온에서 8개의 안정적인 C13 및 N15 동위원소를 조합하여 16개의 리포터를 달성할 수 있습니다(그림 1).

다중화 능력의 증가는 통계적 문제를 극복하기에 충분한 반복실험을 설계할 수 있는 플랫폼을 제공합니다14. 또한, 16-plex TMT의 추가 채널은 채널당 출발 물질의 총량을 줄이는 데 도움이 되며, 이는 새로운 단일 세포 단백질체학15의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 높은 multiplexing 용량은 일반적으로 많은 양의 시작 물질을 필요로 하는 post-translational modifications의 정량화에도 유용할 것입니다16,17.

TMT 기술을 사용하는 단백질체학 워크플로우는 간소화되었으며, 18,19,20 지난10년 동안 시료 전처리, 액체 크로마토그래피 분리, 질량 분석 데이터 수집 및 컴퓨터 분석 측면에서 크게 발전했습니다 21,22,23,24,25,26. 이전 기사에서는 10-plex TMT 플랫폼27에 대한 심층적인 개요를 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 단백질 추출 및 분해, TMT16 라벨링, 시료 풀링 및 탈염, 염기성 pH 및 산성 pH 역상(RP) LC, 고분해능 MS 및 데이터 처리를 포함하여 TMT16에 대해 상세하고 최적화된 방법을 소개합니다(그림 2). 이 프로토콜은 또한 정량적 단백질체학 실험을 성공적으로 완료하기 위해 통합된 주요 품질 관리 단계를 강조합니다. 이 프로토콜은 재현성이 높은 10,000개 이상의 단백질을 식별하고 정량화하여 생물학적 경로, 세포 과정 및 질병 진행을 연구하는 데 일상적으로 사용할 수 있습니다 20,28,29,30.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구를 위한 인체 조직은 배너 선 건강 연구소(Banner Sun Health Research Institute)의 뇌 및 신체 기증 프로그램(Brain and Body Donation Program)의 승인을 받아 획득했습니다.

1. 조직 및 품질 관리에서 단백질 추출

참고: 샘플 채취가 단백질체에 미치는 영향을 줄이려면 가능한 한 저온에서 최소한의 시간에 샘플을 수집하는 것이 중요합니다31. 이는 일반적으로 불안정하기 때문에 번역 후 변형을 분석할 때 특히 중요한데, 예를 들어 일부 인산화 현상은 반감기가 몇 초에 불과하기 때문입니다32,33.

  1. 조직 샘플 절제 및 칭량
    1. 분석 저울을 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브의 무게를 측정하고 드라이아이스에서 튜브를 사전 냉각합니다.
    2. 정의된 영역에서 냉동 조직(예: 인간 뇌 조직, ~10mg)을 작은 조각으로 자르고 조직 조각을 즉시 예냉각된 튜브로 옮깁니다.
      참고: 시료 이질성을 줄이려면 16개 시료 모두에 대해 균일한 크기와 해부학적 영역을 사용하는 것이 중요합니다. 조직에서 얻은 단백질의 양은 일반적으로 조직 무게의 5-10%입니다.
    3. 조직과 함께 튜브의 무게를 측정하고 즉시 튜브를 드라이아이스에 넣습니다. 나머지 15개 샘플도 동일한 절차를 사용하여 처리합니다. 해부 직후 샘플을 드라이아이스에 보관하고 80°C에서 보관하십시오.
  2. 용해 조직 샘플
    1. 실험 당일에 새로운 용해 완충액(50mM HEPES pH 8.5, 8M 요소 및 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트)을 준비합니다. 인산가수분해효소(phosphatase) 억제제는 단백질의 인산화 상태를 보존하기 위해 용해 완충액에 첨가해야 합니다.
      참고: 8M 요소가 얼음 위에 침전되어 샘플 용해 중에 불완전한 단백질 변성이 발생하고 단백질 분해 효율이 감소할 수 있으므로 사용하기 전에 용해 버퍼를 실온에 두십시오.
    2. 각 샘플에 용해 완충액(5 - 10 μg/μL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위해 10 mg 조직당 100 μL 용해 완충액 추가)과 유리 구슬(용해물 부피의 ~20%, 직경 0.5 mm)을 추가합니다.
    3. 4 ° C의 블렌더에서 8 ° 30 초 동안 조직을 용해하고 5 초 동안 휴식을 취하고 샘플이 균질화 될 때까지 반복합니다 (~ 5 사이클).
  3. 용해물의 부분 표본을 준비합니다.
    1. 각 샘플에 대해 최소 2개의 부분 표본을 준비합니다. 작은 부분 표본(~10 μL)은 단백질 농도 분석 및 단백질 품질 평가(예: 양성 대조 단백질의 웨스턴 블로팅 검증)에 사용됩니다. 더 큰 부분 표본(~50 μL)이 단백질체 분석에 사용됩니다.
    2. 부분 표본을 드라이 아이스에 즉시 얼리고 나중에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
  4. 단백질 농도 측정
    참고 : 단백질 농도는 BCA 분석 또는 짧은 SDS 젤 염색 방법34 (그림 3A)로 측정 할 수 있습니다. 조직 용해물의 비단백질 환원 성분이 BCA 분석의 측정에 영향을 미칠 수 있기 때문에 사용자는 짧은 SDS 겔 염색 방법으로 단백질 농도를 검증할 수 있습니다. 짧은 SDS 겔 염색 방법이 여기에 나와 있습니다.
    1. 16개의 분취된 샘플을 10배 희석하고 BSA 표준(예: 0.15, 0.5, 1.5 및 3μg의 BSA 적정)을 준비합니다.
    2. 모든 단백질이 겔 내부로 약 3mm 이동할 때까지 스태킹 겔을 사용하여 10% SDS-PAGE 겔(26웰)에서 샘플과 BSA 표준물질을 실행합니다.
    3. 겔을 쿠마시 블루로 1시간 동안 염색하고 빈 영역의 배경이 깨끗해질 때까지 겔의 염색을 제거합니다.
    4. 겔을 스캔하여 ImageJ로 Coomassie-stained protein bands의 강도를 측정하고 측정값에 따라 BSA 표준 곡선을 생성합니다.
    5. 표준 곡선으로 절대 단백질 농도를 계산합니다.
      참고: 이 실험에서 각 샘플의 최종 단백질 농도는 ~5-10μg/μL였습니다. TMT16 기반 단백질체학 분석의 경우 샘플당 50μg의 단백질(전체 단백질체 분석의 경우 총 0.8mg 단백질)으로 충분합니다.
  5. 샘플 품질 관리
    참고: 이 품질 관리 단계는 TMT 분석을 수행하기 전에 품질이 낮은 샘플을 식별하는 데 중요합니다. 단백질 변화가 알려진 샘플의 경우, 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 변화를 검증하는 것이 좋습니다. 또한 단백질 패턴을 검사하고 분해 정도가 높은 샘플을 제외하기 위해 표준 SDS-PAGE 분석이 권장됩니다(그림 3B).
    1. 작은 부분 표본에서 각 샘플의 ~10μg을 채취하고 브로모페놀 블루 염료가 겔 바닥에 도달할 때까지 그래디언트 SDS-PAGE 겔에서 샘플을 실행합니다.
    2. 젤을 Coomassie blue로 염색하고 젤의 얼룩을 제거합니다. 단백질 품질을 검사하여 심하게 분해된 단백질 샘플을 제거합니다.
      참고: 분해된 샘플은 고분자량 영역에는 단백질 띠가 거의 없고 저분자량 영역에는 강화된 띠가 있는 샘플로 식별할 수 있습니다(그림 3B).

2. 용액 내 단백질 분해, 펩타이드 환원 및 알킬화, 소화 효율 테스트 및 펩타이드 탈염

  1. Lys-C와 트립신에 의한 단백질 분해
    1. 각 샘플의 큰 부분 표본에서 ~50 μg 단백질을 취하고 50 μL에 용해 완충액을 추가합니다.
    2. 100% 아세토니트릴(ACN)을 첨가하여 최종 농도 10%에 도달합니다.
    3. Lys-C를 100:1(w/w)의 protein:Lys-C 비율로 첨가하고 실온에서 3시간 동안 배양하여 Lys-C 분해를 수행합니다.
    4. 샘플은 2M 요소 x 50mM HEPES(pH 8.5)의 최종 농도를 포함하도록 희석됩니다.
    5. 50:1(w/w)의 단백질:트립신 비율로 각 샘플에 트립신을 추가하고 실온에서 3시간 또는 밤새 분해를 수행합니다.
  2. 펩타이드 환원 및 알킬화
    1. 갓 준비한 디티오트레이톨(1M DTT) 용액을 최종 1mM 농도에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 이황화 결합을 줄입니다.
    2. 갓 준비한 요오드아세트아미드(1M IAA) 용액을 암흑에서 30분 동안 최종 10mM 농도에 첨가하여 시스테인 잔기를 알킬레이트합니다.
    3. 최종 30mM 농도에 1M DTT를 첨가하여 미반응 IAA를 퀀싱하고 실온에서 30분 더 배양합니다.
  3. 분해 효율 검사
    1. 각 샘플의 ~1μg을 취하고 제조업체의 프로토콜에 따라 C18 수지 코팅된 피펫 팁을 사용하여 탈염합니다.
    2. 짧은 그래디언트 LC-MS/MS 실행으로 각 샘플을 분석합니다(자세한 내용은 5단계 참조).
    3. MS 원시 데이터에 대한 데이터베이스 검색을 수행합니다(자세한 내용은 6단계 참조). 하나 이상의 트립신 절단 부위가 있는 식별된 펩타이드의 비율을 계산합니다. 백분율은 일반적으로 15% 미만입니다.
    4. 백분율이 15%보다 크면 샘플에 트립신을 추가하여 분해를 반복합니다.
    5. 분해 후 TFA를 0.5%(v/v)에 첨가하여 샘플을 산성화합니다. pH 스트립으로 pH를 확인하여 pH가 3 미만인지 확인합니다.
  4. 펩타이드 탈염
    1. 산성화된 펩타이드를 21,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다.
    2. C18 탈염 컬럼(~25μL 수지)을 500 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 250μL의 100% 메탄올로 두 번 세척합니다.
      참고: 탈염 공정 중 펩타이드의 손실을 줄이려면 투입량과 일치하는 결합 용량을 가진 탈염 컬럼을 선택하십시오.
    3. 250μL의 용리 완충액(60% ACN, 0.1% TFA)을 사용하여 500 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 컬럼을 두 번 세척합니다.
    4. 250μL의 평형을 이루고 500 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 완충액(0.1% TFA)을 세척하여 컬럼을 두 번 평형화합니다.
    5. pre-equilibrated column에 샘플을 불러옵니다. 샘플이 100 x g 에서 6분 동안 회전하여 컬럼에 결합되도록 합니다. 모든 솔루션이 열을 통과했는지 확인합니다.
    6. 250μL의 평형으로 컬럼을 세 번 세척하고 500 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 완충액을 세척합니다.
    7. 각 컬럼에 125μL의 용리 완충액을 추가하고 100 x g 에서 3분 동안 회전하여 펩타이드를 용리합니다. 열에 남은 용액이 없는지 확인합니다.
    8. 용리된 펩타이드를 진공 농축기에서 건조시키고 향후 TMT 라벨링을 위해 펩타이드를 -80°C에서 보관합니다.

3. 펩티드의 TMT16 라벨링, 라벨링 효율 테스트, 샘플 풀링 및 라벨링된 펩타이드 탈염

  1. 펩타이드의 TMT16 라벨링
    1. 탈염된 각 펩타이드 샘플을 50μL의 50mM HEPES(pH 8.5)에 여러 번 볼텍싱하거나 초음파 용해시킨 후 pH 스트립을 사용하여 pH를 확인하여 재현탁합니다.
      알림: 샘플은 라벨링하기 전에 완전히 건조되지 않으면 산성일 수 있으며, 이는 라벨링 효율성에 부정적인 영향을 미칩니다. pH가 7에서 8 사이인지 확인하십시오.
    2. 각 샘플에서 ~1 μg의 비표지 펩타이드를 TMT 라벨링 효율 테스트를 위한 음성 대조군으로 취합니다.
    3. TMT16 시약을 무수 ACN에 용해시킵니다. 1.5:1(w/w)의 TMT:단백질 비율로 시약을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 라벨링 반응을 수행합니다.
      참고: TMT16에 사용되는 TMT:단백질 비율은 TMT11에 사용되는 비율보다 50% 높습니다. 이 작은 불일치는 TMT16의 분자량이 TMT11 시약의 분자량보다 더 크고(1.2배) 때문일 수 있습니다. 단백질의 양은 탈염 중 손실을 고려하지 않고 샘플에서 추정됩니다.
  2. 라벨링 효율성 테스트
    1. 라벨링 효율 테스트를 위해 각 샘플에서 ~1μg의 라벨링된 펩타이드를 채취합니다. 반응을 담금질하지 않고 나머지 샘플을 -80 °C에 놓습니다.
    2. 제조업체의 프로토콜에 따라 C18 수지 코팅 피펫 팁으로 TMT16 라벨링 및 라벨링되지 않은 샘플 각각을 ~1μg 탈염합니다.
    3. LC-MS/MS로 샘플을 분석합니다(그래디언트가 10분이라는 점을 제외하고 섹션 5 참조).
    4. 라벨링되지 않은 샘플과 라벨링되지 않은 샘플 사이의 라벨링되지 않은 펩타이드의 MS1 강도 감소를 분석하여 라벨링 효율을 추정합니다. 6-10개의 서로 다른 펩타이드를 선택하여 라벨링 효율성을 확인하고 모든 펩타이드가 라벨링되었는지 확인합니다.  완전한 라벨링을 위해 라벨링되지 않은 펩타이드는 관찰되지 않습니다.
      참고: 다운스트림의 정확한 단백질 식별 및 정량화를 위해 모든 샘플의 완전한 라벨링을 보장하는 것이 중요합니다.
    5. 라벨링이 완료되지 않은 경우, TMT 시약을 추가하여 나머지 펩타이드를 라벨링하고 퀀칭 전에 라벨링 효율을 다시 확인하십시오. 샘플이 완전히 라벨링된 후 하이드록실아민을 최종 0.5% 농도로 첨가하여 실온에서 반응을 소멸시키고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  3. Sample pooling 및 desalting
    1. 각 TMT 표지 샘플의 절반을 풀링하여 혼합물을 만듭니다.
    2. 혼합물에서 1μg을 취하고 C18 수지 코팅된 피펫 팁으로 탈염한 다음 짧은 그래디언트(~30분)를 사용하여 LC-MS/MS로 분석합니다.
    3. 각 TMT16 리포터 이온의 평균 강도를 사용하여 상대 농도를 계산하고 16개 채널 간의 불일치를 비교합니다. 각 채널의 동일한 혼합을 달성하려면 계산된 평균 강도에 따라 TMT 표지 샘플의 나머지 부분을 혼합물에 추가합니다. 모든 샘플이 균등하게 혼합될 때까지 조정을 반복합니다. 표본 풀링(sample pooling)의 과정을 보여주는 대표적인 데이터는 표 1에 나타나 있다.
      참고: 피펫팅 오류는 농도 및 단백질 정량화의 정확도에 영향을 미칠 수 있기 때문에 풀링량을 올바르게 확인하는 것이 중요합니다. 16개 샘플 간의 강도 차이는 5% 미만이어야 합니다.
  4. 라벨링된 펩타이드 탈염
    참고: TMT16 라벨링 반응의 배경 유도체(예: 하이드록실아민 소광 반응의 TMTpro-NHOH 및 TMT 하이드록실화의 TMTpro-OH)는 소수성이기 때문에 유도체를 효과적으로 제거하기 위해 TMT16 라벨링 샘플에 광범위한 세척 조건이 사용됩니다. 일반 세척 버퍼에 5% ACN(0.1% TFA)을 추가하고 10x 베드 부피의 세척 버퍼를 사용합니다.
    1. pH < 3에 10% TFA를 추가하여 풀링된 샘플을 산성화합니다.
    2. 풀링된 샘플을 21,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 새 튜브에 넣습니다.
    3. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 건조시켜 ACN을 제거합니다.
    4. 50mg 흡착제 컬럼을 2mL의 100% 메탄올로 세척한 후 2mL의 용리 완충액(60% ACN과 0.1% TFA), 마지막으로 2mL의 세척 완충액(0.1% TFA)으로 세척하여 50mg의 고체상 추출 카트리지를 사전 컨디셔닝합니다.
    5. 컬럼에 샘플을 로드합니다. 펩타이드 결합의 전체 범위를 보장하기 위해 유속을 ~100μL/min으로 조정합니다. 흐름을 저장합니다.
    6. 1mL 세척 버퍼로 컬럼을 세 번 세척합니다.
    7. 1mL 용출 완충액을 사용한 용출 펩타이드.
    8. 용리된 펩타이드를 진공 농축기에서 건조시키고 추가 분획을 위해 펩타이드를 -80°C에서 보관합니다.

4. 오프라인 염기성 pH LC 사전 분획

  1. 분별 시스템 준비
    1. 마이크로리터 흐름의 고성능 LC 시스템을 위해 완충액 A(10mM 포름산암모늄, pH 8.0) 및 완충액 B(10mM 포름산암모늄, 90% ACN, pH 8.0)를 준비합니다.
    2. 분획을 위해 가교 에틸렌 하이브리드 입자(입자 크기 3.5μm, 4.6mm × 25cm)를 포함하는 HPLC 컬럼을 마이크로리터 흐름의 고성능 LC 시스템에 설정합니다.
    3. 100μL 샘플 루프를 설치하고 300μL의 메탄올, 물 및 버퍼 A로 루프를 순차적으로 세척합니다.
    4. 100μL의 1:1:1:1 비율의 이소프로판올 : 메탄올 : 아세토니트릴 : 물을 사용하여 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 버퍼 A의 95%에서 0.5시간 동안 컬럼을 추가로 평형화합니다.
  2. 시료 전처리
    1. 풀링 및 탈염된 TMT16 샘플을 70μL의 버퍼 A에 용해시킵니다.샘플 pH가 ~ 8.0인지 확인합니다. 여전히 산성인 경우 28% 수산화암모늄(NH4OH)을 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다.
      알림: 샘플 손실을 피하기 위해ample 볼륨은 루프 볼륨의 70% 미만이어야 합니다.
    2. 21,000 x g 에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 침전물을 제거합니다.
  3. 분별 및 연결
    참고: 실제 시료 분별 전에 LC 시스템의 양호한 상태를 확인하기 위해 파일럿 실험을 적극 권장합니다. 이는 소량의 실제 샘플(~5%) 또는 TMT가 아닌 라벨링된 펩타이드 혼합물을 사용하여 수행할 수 있습니다.
    1. 샘플을 주입하고 10분 동안 5% 버퍼 B, 2분 동안 5-15% 버퍼 B, 148분 동안 15-45% 버퍼 B, 5분 동안 45-95% 버퍼 B로 분별합니다. 0.4mL/분의 유속을 사용합니다.
    2. 분획 분취기를 설정하여 1분마다 분획을 수집하고 4주기에서 160개의 분획을 40개의 분획으로 다시 결합합니다.
      참고: 연결은 동일한 시간 내부에서 용리된 초기, 중간 및 후기 LC 분획을 연결된 분획으로 결합하여 수행됩니다. 연결된 분획은 LC의 첫 번째 차원에서 겹치는 부분이 거의 없으므로 두 번째 차원 LC에서 용출 창의 효율적인 사용을 증가시킵니다. 또한, 여러 차례의 접합을 통해 펩타이드는 연결된 모든 분획에 고르게 분포될 수 있습니다. 이 접근법은 개별 분획35,36의 분석과 비교하여 단백질체 커버리지를 증가시키는 것으로 입증되었습니다.
    3. 진공 농축기에서 모든 연쇄 분획을 건조하고 추가 LC-MS/MS 분석을 위해 건조된 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.

5. 산성 pH RPLC-MS/MS 분석

  1. 산성 pH RPLC-MS/MS 시스템 준비
    1. 빈 컬럼(15μm 팁 오리피스가 있는 75μm ID)에 1.9μm C18 수지를 10-15cm 길이로 포장합니다.
    2. 배압을 줄이기 위해 버터플라이 포트폴리오 히터를 사용하여 컬럼을 65°C로 가열합니다.
    3. 95% 완충액 B(3% 디메틸 설폭사이드, 0.2% 포름산 및 67% ACN)로 컬럼을 철저히 세척합니다. 그런 다음 95% 버퍼 A(3% 디메틸 설폭사이드 및 0.2% 포름산)에서 컬럼을 완전히 평형화합니다.
    4. 실험 샘플을 분석하기 전에 100ng의 쥐 뇌 펩타이드 또는 BSA 펩타이드를 실행하여 LC-MS/MS 시스템의 성능을 확인하십시오.
  2. 연쇄 분획의 LC-MS/MS 분석
    1. 염기성 pH 분획물에서 건조된 펩타이드를 5% FA로 재구성하고 21,000 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 각 샘플의 상등액을 HPLC 바이알 인서트로 옮깁니다.
    2. 각 분획의 ~1μg 펩타이드를 컬럼에 로드합니다. 펩타이드는 0.25μL/min 유속으로 용리되며, 60분 동안 18–45% buffer: B를 얻을 수 있습니다.
      참고: 높은 식별 번호를 얻으려면 하나의 분수를 실행하고 첫 번째 실행을 기준으로 나머지 분수에 대한 기울기를 조정합니다. 최상의 그래디언트는 전체 그래디언트에 걸쳐 펩타이드가 고르게 분포되어 있어야 합니다(그림 4A).
    3. TMT16 표지 샘플의 분석을 위해 다음 매개변수로 질량 분석기를 작동하십시오: MS1 스캔(전체 MS 스캔 범위: 450-1600m /z; Orbitrap 분해능: 60,000; 자동 이득 제어 대상: 1 x 106; 최대 이온 시간: 50ms) 및 20개의 데이터 종속 MS2 스캔(Orbitrap 해상도: 60,000; AGC 타겟: 1 x 105; 최대 이온 시간: 110ms; HCD 정규화 충돌 에너지: 32%; 격리 창: 1.0m /z; 절연 오프셋: 0.2m /z; 동적 제외: 10초).
      참고: 여기에 사용된 매개변수는 한 가지 유형의 질량 분석기에 최적화되어 있습니다( 재료 표 참조). 다양한 MS 기기의 경우 사용자는 고품질 결과를 얻기 위해 기기 파라미터를 미세 조정해야 합니다. 한 가지 설정은 최적 에너지가 TMT11과 TMT16 사이뿐만 아니라 기기에 따라 다를 수 있으므로 정규화된 HCD 충돌 에너지를 모니터링하는 것입니다.

6. 데이터 처리

참고: 데이터 분석은 하이브리드 데이터베이스 검색 엔진(패턴 및 태그 기반), 식별된 펩타이드/단백질의 거짓 발견률(FDR)을 제어하는 필터링 소프트웨어 및 TMT 데이터 세트에 대한 정량화 소프트웨어를 포함하는 JUMP 소프트웨어 제품군 37,38,39를 사용하여 수행되었습니다. 사용자의 상황에 따라 다른 상용 또는 무료로 사용할 수 있는 프로그램을 사용하여 데이터 분석을 수행할 수 있습니다.

  1. 데이터베이스 검색
    1. MS 기기의 .raw 파일을 .mzXML 파일로 변환하고, UniProt 인간 단백질 염기서열에서 생성된 비중복 표적 미끼 데이터베이스(40 )에 대해 MS2 스펙트럼을 검색하고(또는 다른 적절한 종 특이적 데이터베이스)을 통해 식별된 단백질의 FDR을 계산합니다.
      참고: Swiss-Prot 및 TrEMBL 데이터베이스의 단백질 염기서열을 결합하여 비중복 데이터베이스를 생성합니다. 또한 프로테아제 절단 단백질, 단일 뉴클레오티드 다형성을 가진 단백질 및 일반적인 오염 물질을 포함하여 이러한 참조 데이터베이스에 포함되지 않은 맞춤형 단백질 염기서열을 추가할 수 있습니다.
    2. 다음 매개 변수를 사용하여 검색을 수행합니다. 전구체에 대한 질량 허용 오차 : 10ppm; 제품 이온을 위한 질량 포용력: 15 ppm; 최대 놓친 분열: 2; 최대 수정 부위 : 3; 정적 변형: Lys 잔기 및 N 말단의 TMT16 태그에 대한 304.20715 Da, Cys 잔기의 카바미도메틸화에 대한 57.02146 Da; 동적 변형 : Met의 산화를위한 15.99492 Da.
  2. 검색 결과 필터링
    1. 펩타이드 길이(>6 아미노산), 전구체 이온의 질량 정확도 및 JUMP 기반 정합 점수(Jscore 및 ΔJn)를 기준으로 결과 펩타이드-스펙트럼 일치(PSM)를 필터링합니다. 그런 다음 펩타이드를 펩타이드 길이, 트립틱 말단, 변형, 누락된 절단 부위 및 전하 상태별로 그룹화합니다.
    2. 일치하는 점수로 데이터를 추가로 필터링하여 단백질(전체 단백질체 분석) 또는 펩타이드(인단백질체 분석) 수준에서 1% 미만의 FDR을 달성합니다.
      참고: 양성 대조군 펩타이드/단백질이 필터링 단계에서 누락된 경우 FDR을 합리적인 수준으로 증가시켜 해당 펩타이드/단백질을 구할 수 있습니다.
    3. 단백질 계열의 두 개 이상의 구성원이 공유하는 펩타이드의 경우, 일치하는 구성원을 하나의 그룹으로 클러스터링합니다.
      참고: parsimony의 법칙에 따라 그룹은 가장 많은 수의 공유 펩타이드를 가진 상동 단백질과 고유한 펩타이드와 일치하는 다른 단백질로 표시됩니다.
  3. 단백질 정량화
    1. 통계 소프트웨어 제품군의 내장 프로그램을 사용하여 단백질을 정량화하여 일치하는 모든 PSM에 대한 TMT 리포터 이온 강도를 요약합니다.
    2. 허용된 각 PSM에서 TMT 리포터 이온 강도를 추출하고 각 라벨링 시약의 동위원소 분포에 따라 원시 강도를 보정하고(예: TMT16-126은 126, 127C 및 128C m/z 이온의 92.6%, 7.2% 및 0.2% 생성) 사용자 정의 임계값을 기반으로 저강도 및/또는 잡음이 높은 PSM을 필터링합니다. loading-bias를 수정하기 위해 샘플의 trimmed-mean(또는 median) 강도를 사용하여 정량 데이터를 정규화합니다.
    3. 식별된 각 단백질에 대해 일치하는 PSM의 샘플 전반에 걸친 평균 중심 강도(즉, 상대 강도)를 계산하고 샘플별 평균을 취하여 PSM의 상대 강도를 요약합니다. 가장 풍부한 3개의 정합 PSM의 전체 평균 강도를 곱하여 상대 신호를 절대 신호로 변환합니다.
    4. 이전에 보고된 y1 이온 보정 접근법(37 )을 사용하여 y1 이온 강도가 리포터 이온 강도와 상관관계가 있다고 가정하는 올바른 정량 간섭. 클린 스캔에서 y1과 리포터 이온 강도 사이의 선형 관계를 추정함으로써 노이즈 스캔에서 오염된 y1 이온 강도의 간섭 수준을 도출하고 보정합니다.
      참고: TMT 표지 트립틱 펩타이드의 경우, K-TMT 및 R 잔기는 MS2 스펙트럼에서 두 개의 대표적인 y1 이온(각각 376.27574 Da 및 175.11895 Da)입니다. y1 이온이 하나만 검출되고 식별된 펩타이드와 일치하는 경우 MS2는 클린 스캔으로 간주됩니다. 두 y1 이온이 모두 검출되면 MS2는 잡음이 있는 스캔으로 간주됩니다.
    5. 추가 분석을 위해 단백질 정량 분석 값을 스프레드시트로 전송합니다. PCA 또는 클러스터링 분석과 같은 비지도 데이터 분석 방법을 사용하여 샘플의 분포를 탐색합니다. 차등적으로 발현된 단백질을 식별하려면 t-검정 및 분산 분석(ANOVA)과 같은 통계적 방법을 사용합니다.

7. MS 데이터 검증

참고: 시간이 많이 소요되는 생물학적 실험을 수행하기 전에 하나 이상의 검증 방법을 사용하여 MS 데이터의 품질을 평가하십시오.

  1. 관심 단백질의 MS/MS 스펙트럼을 수동으로 검사하여 펩타이드 염기서열 및 TMT 리포터 이온 강도를 검증합니다.
  2. 항체 기반 접근법(예: 웨스턴 블로팅 또는 면역조직화학 분석)을 사용하여 단백질 수준의 변화를 확인할 수 있습니다. 네이티브 펩타이드의 존재를 확인하려면 합성 펩타이드를 내부 표준물질로 사용하십시오. LC-MS/MS 중 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼 및 머무름 시간은 동일한 조건에서 동일해야 합니다.
  3. 표적 MS 접근법을 사용하여 단백질 변화를 검증합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

라벨링 반응, 탈염 및 LC-MS 조건을 포함하여 새로 개발된 TMT16에 대한 프로토콜은 체계적으로 최적화되었습니다41. 또한, 11-plex 및 16-plex 방법을 사용하여 동일한 인간 AD 샘플을 분석하여 직접 비교했습니다41. TMT16에 대한 주요 매개변수를 최적화한 후 TMT11 및 TMT16 방법 모두 > 10,000개의 인간 단백질에서 100,000개의 펩타이드> 유사한 단백질체 범위, 식별 및 정량화를 생성합니다.

TMT16 시약은 TMT11 시약보다 소수성이 더 높기 때문에 TMT16 표지 펩타이드는 TMT11 표지 펩타이드보다 소수성이 더 높을 수 있으며, 이는 RPLC에서 다른 머무름 시간(RT)을 설명할 수 있습니다. 따라서 LC-MS/MS를 사용하여 TMT11 및 TMT16 표지 펩타이드 혼합물을 분석하여 TMT11과 비교하여 TMT16이 펩타이드 RT에 미...

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토론

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TMT16 기반 심층 단백질체 프로파일링을 위한 최적화된 프로토콜은 이전 간행물 12,13,41에서 성공적으로 구현되었습니다. 이 최신 프로토콜을 사용하면 최대 16개의 서로 다른 샘플에서 추출한 10,000개 이상의 고유 단백질을 단일 실험에서 높은 정밀도로 일상적으로 정량화할 수 있습니다.

고품질 결과를 얻으려면 프로토콜 전반에 걸쳐 중요한 단계에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이전 기사27에서 논의한 모든 QC 단계 외에도 TMT16 프로세스에 특정한 추가 필수 단계가 포함되어 있습니다. 이러한 단계는 성공적인 실험을 보장하는 데 중요합니다. 예를 들어, TMT 반응 유도체(예: 하이드록실아민 소광 반응...

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909, U54NS110435)과 ALSAC(미국 레바논 시리아 연합 자선단체)의 일부 지원을 받았다. MS 분석은 NIH Cancer Center Support Grant(P30CA021765)의 일부 지원을 받는 St. Jude Children's Research Hospital의 단백질체학 및 대사체학 센터에서 수행되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% Criterion TGX 프리캐스트 미디 단백질 젤Biorad5671035
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) 버퍼BioRad161-0772
4– 20% Criterion TGX 프리캐스트 미디 단백질 젤Biorad5671095
50% 하이드록실아민Thermo Scientific90115
6 X SDS 샘플 로딩 버퍼Boston Bioproducts IncBP-111R
포름산암모늄(NH4COOH)시그마70221-25G-F
수산화암모늄, 28%시그마338818-100ml
총알 블렌더넥스트 어드밴스BB24-AU
버터플라이 포트폴리오 히터피닉스 S& TPST-BPH-20
C18 ZiptipsHarvard Apparatus74-4607
디티오트레이톨(DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
포름산Sigma94318
분획 수집기GilsonFC203B
젤 코드 블루 스테인 시약온도24592
유리 구슬다음 사전GB05
HEPES시그마H3375
HPLC 등급 아세토 니트릴Burdick & 잭슨AH015-4
HPLC 등급 물Burdick & JacksonAH365-4
Iodoacetamide (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
질량Thermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA 소화 표준Waters186002329
메탄올Burdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 수지, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
자체 팩 컬럼새로운 대물렌즈PF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960염에 사용되는
데옥시콜레이트나트륨 Sigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex 라벨 시약 세트Thermo ScientificA44520
트리플루오로아세트산(TFA)Applied Biosystems400003
TrypsinPromegaV511C
울트라 마이크로 스핀 컬럼, C18하버드 장치74-7206탈염에 사용
시그마U5378
Xbridge 컬럼 C18 컬럼Waters186003943염기성 pH LC에 사용
탈염에 사용 분석기 탈 요소

참고문헌

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