난소암 줄기세포(OCSC)는 암 시작, 재발, 치료 내성 및 전이를 담당합니다. OCSC 혈관 틈새는 OCSC의 자가 재생을 촉진하여 화학 내성을 유발하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 재현 가능한 OCSC 혈관 틈새 모델을 구축하기 위한 기초를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
암 줄기 세포 (CSC)는지지 틈새 시장에 상주하여 인접한 기질 세포, 혈관 및 세포 외 기질로 구성된 미세 환경을 구성합니다. 내피 발달에 참여하는 CSC의 능력은 종양 발생 및 종양 전이의 메커니즘에 대한 일반적인 이해에 직접적으로 기여하는 중요한 특성을 구성합니다. 이 연구의 목적은 난소암 줄기세포(OCSC)의 종양 개시 능력을 조사하기 위한 재현 가능한 방법론을 확립하는 것입니다. 본 발명에서는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포와 OCSC 사이의 신생혈관형성 메커니즘과 내피 세포의 형태학적 변화를 조사했습니다. 이 프로토콜은 OCSC를 둘러싼 신생 혈관 단계를 시간 경과 방식으로 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 종양 전이에서 OCSC의 혈관 신생 특성에 관한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
서론
난소암은 전 세계적으로 여성에게 8번째로 흔한 악성 종양으로, 매년 약 300,000건의 새로운 진단과 약 180,000명의 사망이발생합니다1. 초기 진단에서 난소 암은 종종 심각한 증상을 나타내며 환자의 약 75 %가 이미 III-IV 기에 있습니다. 이에 따라 부인암2 중 5년 생존율이 <30%, 사망률이 가장 높으며, 난소암의 치료 효율은 용적폐 수술의 성공적 성취, 항암에 대한 내성, 초기 치료 후 재발 등의 임상적 요인에 크게 의존한다.
난소암 조직은 계층적으로 구성되어 있으며 모든 종양 구성 요소가 동등하게 자손을 생성할 수 있는 것은 아닙니다. 자가 재생하고 이질적인 종양 세포 집단을 생성할 수 있는 유일한 세포는 암 줄기 세포(CSC)를 나타내는 것으로 간주됩니다3. CSC 자가 재생 및 종양 개시는 지지적 틈새를 유지하기 위한 목적으로 종양 미세환경을 리모델링하기 위한 혈관신생의 촉진을 동반한다. 그러나 이전 모델은 다중 계대 배양 후 스페로이드의 파괴로 인해 임상 샘플에서 파생된 CSC 배양의 재현성이 제한적이기 때문에 시험관 내 분석에 활용할 수 없었습니다. 보다 최근에, 환자로부터 CSC를 배양....
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프로토콜
모든 절차는 인간 복지 윤리위원회가 승인 한 의정서에 따라 수행되었습니다. 모든 환자는 샘플의 연구 사용에 대한 서면 동의서를 제출했으며,이 연구를위한 조직의 수집 및 사용은 테이 쿄 대학의 인간 게놈, 유전자 분석 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 레벨 2 생물안전 캐비닛에서 난소암 및 복수 환자의 난소암 줄기세포(OCSC) 분리 및 배양
- 천자를 통해 얻은 인간 난소 암 복수에서 암 줄기 세포를 분리합니다. 충분한 수의 암 줄기 세포를 채취하기 위해 환자로부터 최소 100-250mL의 복수를 수집하십시오. 추가적으로, 암 줄기 세포 마커 (즉, EpCAM, 칼레티닌, CD133, CD44, CD45, ALDH1, 및 Oct4) 및 난소암 마커 (pAX-8, WT-1)의 발현 프로필을 유세포분석에 의해 평가한다.
- 복수 흡인 후 24시간 이내에 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 인간 난소암 복수를 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 OCSC 배지 2mL와 30% 히스토덴츠/인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 용액 8mL를 추가합니다.
- OCSC 배지 준비: 스템프로 hESC 보충제, L-글루타민(글루타맥스 배지), 25% BSA, 100μM....
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결과
스페로이드에 대한 장기간 안정적인 배양을 수행하기 위해 수술 또는 천자 중 진행성 난소암 환자로부터 얻은 복수액을 수집했습니다. 여기에서는 CSC1 및 CSC2라고 하는 난소 CSC의 장기 스페로이드 배양 사례를 제시합니다. 두 세포주 모두 동일한 진단 및 조직 학적 프로파일을 가지고 있습니다. OCSC를 둘러싼 내피 세포의 신생 혈관을 유도하는 데 필요한 내피 세포와의 상호 작용의 기초가되는 OCSC의 기계 론적 역할은 아직 알려지지 않았습니다. 따라서 우리는 전이 부위에서 CSC 혈관 틈새 발달 과정을 명확히하는 것을 목표로했습니다. 우리는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포 (HUEhT-1)와 OCSC 간의 상호 작용을 조사했습니다. 도 1은 CSC1 및 CSC2에 의해 유도된 튜브 형성 활성의 비교를 나타낸다. 형성된 혈관 튜브의 수는 CSC2와의 공동 배양에서 시간이 지남에 따라 극적.......
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토론
제시된 프로토콜은 시험관 내 설정에서 OCSC의 종양 미세 환경을 모방하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 주요 구성 요소는 간접 Transwell 공동 배양 시스템인 NICO-1 시스템을 사용하여 얻은 재현성이 높은 공동 배양 모델을 구성합니다. 현재 이용 가능한 많은 공동 배양 모델은 공동 배양 된 세포 집단 12,13,14,15,16,17,18에 대한 직접적인 세포-세포 접촉의 효과를 조사합니다. 공동배양의 효과를 조사하는데 사용될 수 있는 가장 간단한 모델은 2개의 세포 유형의 직접 혼합에 의해 재현될 수 있고,.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 일본 문부 과학문화부의 과학 연구 C 보조금(K.N.에 대한 보조금 번호 19K09834)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.025% 트립신 | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 &마이크로; L 피펫 팁 | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL 튜브 | Nunc | 339650 | |
| 200 µ L 피펫 팁 | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| 원심분리기 | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | 프로모셀 | C-22011 | |
| 에탄올 | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µ m | 긴레이 연구실 | 2525-06 | |
| 인슐린, 인간 | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| 광도계 | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| 현미경 | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| 전송 Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | 와코 | 253-00513 |
참고문헌
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E.
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재인쇄 및 허가
