신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
알츠하이머 병 (AD) 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 희소 돌기 부전은 일반적인 초기 병리학 적 특징이지만 특히 뇌의 회백질에서 질병 발달 및 진행에 어떻게 기여하는지는 거의 알려지지 않았습니다. 희소돌기아교세포 계통 세포의 기능 장애는 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)의 수초화 결핍 및 자가 재생 장애로 특징지어집니다. 이 두 가지 결함은 병리학의 축적을 따라 뉴런과 희소돌기아교세포 사이의 상호 작용이 중단되어 적어도 부분적으로 발생합니다. OPC는 CNS 발달 동안 수초 희소돌기아교세포를 생성합니다. 성숙한 뇌 피질에서 OPC는 주요 증식 세포 (전체 뇌 세포의 ~ 5 %를 구성)이며 신경 활동 의존적 방식으로 새로운 미엘린 형성을 제어합니다. 이러한 뉴런-희소돌기아교세포 통신은 적절한 도구의 부족으로 인해 특히 AD와 같은 신경퇴행성 상태의 맥락에서 상당히 과소 연구되고 있습니다. 최근 몇 년 동안 우리 그룹과 다른 사람들은 인간 만능 줄기 세포에서 개별적으로 기능성 뉴런과 희소돌기아교세포를 생성하기 위해 현재 사용 가능한 프로토콜을 개선하기 위해 상당한 진전을 이루었습니다. 이 원고에서는 뉴런-희소돌기아교세포 연결을 모델링하기 위한 공동 배양 시스템의 구축을 포함하여 최적화된 절차에 대해 설명합니다. 우리의 예시적인 결과는 뇌 아밀로이드증 및 시냅스 무결성에 대한 OPC/희소돌기아교세포의 예상치 못한 기여를 시사하고 AD 연구를 위한 이 방법론의 유용성을 강조합니다. 이 환원 주의적 접근법은 뇌 내부의 고유 한 복잡성에서 특정 이종 세포 상호 작용을 해부하는 강력한 도구입니다. 여기에서 설명하는 프로토콜은 신경 퇴행의 발병 기전에서 희소돌기전 결함에 대한 향후 연구를 용이하게 할 것으로 예상됩니다.
서론
희소돌기아교세포 전구세포(OPC), 수초 희소돌기아교세포 및 그 사이의 전이 유형을 포함한 희소돌기아교세포 계통 세포는 신경 발달 및 노화 전반에 걸쳐 중추신경계의 적절한 작동 및 유지를 위한 많은 중요한 기능에 적극적으로 참여하는 인간 뇌 세포1의 주요 그룹을 구성합니다.2,3,4 . 희소돌기아교세포는 백질에서 신경 활동 전달을 촉진하고 축삭 건강을 지원하기 위해 미엘린을 생성하는 것으로 잘 알려져 있지만, OPC는 수초화가 부족한 회백질에 풍부하고(~5%) 학습 행동 및 기억 형성을 제어하는 활동 의존적 신호 기능을 수행합니다. 5,6,7,8 . 알츠하이머병(AD) 및 기타 연령 관련 신경퇴행성 질환의 발병기전에서 희소돌기아세포 기능 및 기능 장애가 어떻게 연구되었는지는 연구되지 않았습니다9. 적절한 모델 시스....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 인간 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 유도
- 렌티바이러스 준비(~5일, 앞서 설명한 세부 프로토콜16)
- 각 T75 플라스크에 ~100만 개의 HEK293T 세포를 플레이트하여 형질감염을 수행할 때 ~40% 합류하도록 합니다. 테트라사이클린 유도성 Ngn2 및 퓨로마이신 내성 유전자(PuroR, 동일한 TetO 프로모터 대조군 하에서), rtTA 및 3개의 헬퍼 플라스미드 pRSV-REV, pMDLg/pRRE 및 VSV-G(렌티바이러스 벡터 DNA 12μg 및 각 헬퍼 플라스미드 DNA 6μg)를 발현하는 플라스미드로 형질감염시킵니다. 렌티 바이러스 준비 당 최소 3 개의 플라스크를 준비하십시오. 제조업체의 지시에 따라 형질주입을 위해 PEI를 사용하십시오. 16시간 후에 미디어를 교체하고 폐기하십시오.
- Harvest는 매일 배양 배지를 수집하여 바이러스 입자를 방출하고 3 일 동안 신선한 배지로 교체했습니다. 정제를 위해 바이러스 입자가 포함된 수집된 배지를 풀링합니다. 0.22μm 필터를 통해 바이러스를 여과하고 49,000 x g 에서 90분 동안 원심분리합니다. 적절한 양의 PBS- 포도당 (~ 150 μL)에 펠릿을 재현 탁하십시오.
- 뉴런....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
인간 만능 줄기 세포에서 인간 유도 뉴런의 직접 생성
시작하는 인간 다 능성 줄기 세포가 iN 또는 iOPC / iOL의 성공적인 생성을 위해 높은 수준의 다 능성을 나타내는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 세포는 본 원고에 기재된 유도 프로토콜 중 하나를 시작하기 전에 Oct4 및 SOX2와 같은 특정 마커에 대해 염색되어야 한다(도 1A). 인간 H1 세포는 Zhang et al.에 의해 이전에 발표된 프로토콜에 따라 유도된 흥분성 전뇌 뉴런을 얻기 위해 사용되었으며, 일부 변형(그림 1C)12,16,17,18이 있었습니다. 여기에서는 2 일째의 iN이 피더.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
시냅스 구조를 안정화시키고 수초화에 의한 염분 신호 전도를 촉진하는 물리적 및 대사적 지원 외에도 희소돌기아교세포 계통 세포는 뉴런 5,6,7과의 빠르고 역동적인 혼선을 통해 뉴런 활동 패턴을 형성할 수 있습니다. AD 병리학에서 희소돌기아교세포 반응은 처음에는 염증 및 산화 스트레스에 이차적인 것으로 간주되었지만, 이제 손상된 미엘린 완전성이 Aβ 응집 및 타우 과인산화9가 나타나기 전의 초기 병원성 사건이라고 주장하는 유망한 증거가 있습니다. 더욱이, OPC의 자가 갱신을 통한 수초화의 복구는 AD38에서 특히 취약한데, 이는 뉴런 활동에 크게 의존하는 과정이다. 따라서 건강한 뉴런-희소돌기아교세포 신호 전달을 지원하는 메커니즘을 이해하는 것은 새로운 치료 표적을 식별할 수 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 (R00 AG054616에서 YAH, T32 GM136566에서 KC), 스탠포드 의과 대학 및 Siebel Fellowship (SC에 수여)의 보조금으로 지원되었습니다. YAH는 브라운 중개 과학 연구소의 중개 신경 과학 센터의 GFL 번역 교수입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 보충제 | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| 독시사이클린 | 밀리포어시그마 | D3072 | |
| 소 태아 혈청 | ScienCell | 10 | |
| H1 인간 ES 세포 | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 보충제 | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A 매체 | ThermoFisher | 10888-022 | |
| 비 필수 아미노산 | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R & D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | 애드겐 | 12251 | |
| 폴리브레인 | 밀리포어시그마 | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | 애드진 | 12253 | |
| 퓨로마이신 | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK 억제제 Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff 신경 전구 냉동 매체 | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi 신경 유도 키트 | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 트리요오드티로닌 | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: 인간 iPSC 유래 OPC | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-NG2-Puro | 애드겐 | 52047 | |
| VSV-G | 애드겐 | 12259 |
참고문헌
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 6....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.
The fourth paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F).
태그
