현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.
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이 논문에서
요약
초록
적응력의 특징인 면역력은 T와 B 림프구에 의해 오케스트레이션됩니다. 순환 및 상이한 장기에서는 수십억 개의 고유한 T 및 B 세포 클론이 있으며, 각각 특정 항원을 결합하여 증식, 분화 및/또는 사이토카인 분비로 이어질 수 있습니다. T와 B 세포에 있는 광대한 이질성은 다른 유전 세그먼트의 무작위 재조합에 의해 생성됩니다. 지난 10년간 개발된 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리에 대한 전례 없는 심층뷰를 가능하게 합니다. 다양한 염증 성 조건, 면역 결핍, 감염 및 악성 종양에 대한 연구는 다른 장애에서 적응 성 면역 반응의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공, 면역 레퍼토리의 복제, 유전자 사용 및 생물 학적 특성에 현저한 변화를 보여 주었다.
여기에서, 우리는 혈액과 조직에서 T와 B 세포의 면역 레퍼토리의 NGS를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 라이브러리 준비를 통해 DNA 격리에서 시작하여 NGS 시퀀서에 대한 시퀀싱및 기본 분석으로 끝나는 파이프라인을 제공합니다. 이 방법은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 특정 T 및 B 세포의 탐사를 가능하게 하고, 따라서 다른 질병에 있는 림프구 인구 및 다양성 매개변수에 있는 동적 변경을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 천천히 임상 사례를 입력하고 새로운 바이오 마커의 식별을위한 잠재력을 가지고, 위험 계층화 및 정밀 의학.
서론
T와 B 림프구로 구성된 적응형 면역 계통은 면역 학적 기억을 활용하여 이전에 만난 항원을 인식하고 신속한 반응을 시작합니다. 림프구는 골수에서 생성되고 흉선 (T 세포) 또는 골수 (B 세포)에서 성숙합니다. T 세포 수용체(TCR) 및 BCR(BCR) 둘 다 특정 항원인식을 허용하는 독특한 구성을 표시합니다. 항상성에서, T와 B 세포는 항원 제시 세포에 제시된 다른 펩티드의 수조를 끊임없이 순환하고 조사합니다. TCR 또는 BCR 결찰은 적절한 동자극과 함께, 세포 활성화로 이어지며, 그 결과 세포비콘 분비, 복제 팽창 및 항체의 생성을 초래하여 B 세포의 경우.
다른 T 또는 B 세포의 거대한 배열은 집합적으로 면역 레퍼토리라고, 다른 전형의 수많은 인식을 가능하게. 이러한 광대한 레퍼토리를 생성하기 위해, 다른 유전자 세그먼트의 임의 조립의 복잡한 과정이 발생, 독특한 항원1을결합 할 수있는 수용체의 거의 끝없는 조합을 생성. V(D)J 재조합이라고 하는 이 과정은접합부 2에서임의 삭제 및 뉴클레오티드 삽입과 함께 상이한 변수(V), 다양성(D) 및 결합(J) 유전자의 재배열을 포함한다.
적응형 면역....
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프로토콜
이 연구는 셰바 의료 센터의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 모든 참여 과목에서 서면 동의를 얻었습니다.
1. DNA 격리 및 정량화
- 장생검의 소화 및 세포 용해
- 새로 수집하거나 -20 °C 또는 -80 ° C에 저장된 장 생검을 검색하십시오. 냉동 생검을 사용하는 경우, 얼음에 해동.
- 얼음 에 차가운 멸균 1.7 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 핵 용해 용액 600 μL을 추가합니다.
- 용액이 있는 마이크로센심분리기 튜브에 생검을 넣고 65°C에서 15-30분 동안 배양합니다.
- 20 mg / mL 단백질 Ae K의 17.5 μL을 추가하고 부드러운 흔들림과 함께 55 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 1.3단계로 진행하기 전에 샘플을 실온까지 5분 동안 식힙니다.
- 전혈의 세포 리시스
- EDTA, 헤파린 또는 구산염 함유 튜브에서 3mL의 전혈을 얻습니다.
- 철저히 혼합될 때까지 부드럽게 암투하고, 9mL의 세포 용액을 함유한 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 혈액을 전달합니다. 실온에서 10 분 잠복기 동안 여러 번 반전하십시오.
- 실....
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결과
본명, 장 조직 및 혈액으로부터의 DNA 절연 방법, NGS용 라이브러리 준비, 면역 레퍼토리 시퀀싱을 위한 시퀀싱 실행의 기본 단계를 설명한다. 이 실행은 국제 ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST 플랫폼에서 사용하기 위해 fasta 파일로 추가 변환 할 수있는 fastq 파일을 생성합니다. 이 HTS는 뉴클레오티드 레벨15에서수만 개의 재배열된 TCRβ 및 IGH 서열의 많은 분석을 수행하고 관리한다. IMGT/HighV-QUEST를 사용하면 건강과 질병 모두에서 다양한 TCR 및 IGH 레퍼토리를 분석할 수 있습니다. 이것은 새로운 "질병 특정" 클론의 식별, 복제 확장 및 다양성 매개 변수의 분석, 차동 V (D)J 사용의 묘사, 체세포 하이퍼 돌연변이의 분석 및 더 많은 것으로 이어질 수 있습니다. IMGT/HighV-QUEST는 특정 시퀀스와 풍부한 순서를 포함하는 CSV 파일을 제공합니다. 게놈 DNA를 시작 재료로 사용하면 세포 수를 대표하는 서열 .......
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토론
B와 T 림프구의 풍부함과 기능의 변화는 종종 다른악성(18),만성 염증장애(예를 들어, 궤양성 대장염 및 류마티스 관절염)10,19,및 다양한 면역결핍(17,20)에서종종 발생한다. 현재 방법은 NGS를 활용하여 TCR 및 BCR 레퍼토리의 심층적 시각을 용이하게 하여 T 및 B 세포 클론의 미묘한 변화, 클론 공유, V(D)J 유전자 사용 및 B 세포의 경우 체세포 하이퍼 돌연변이의 정도에 대한 정보를 가능하게 합니다.
DNA 격리 방법은 장 생검 및 혈액 샘플을 위해 기술되었다. 그러나, 리시스 및 DNA 추출의 수정으로, 방법은 종양, 림프절, 활액 등과 같은 그밖 조직에 적용될 수 있습니다. 라이브러리 준비 중에 다른 프.......
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공개 사항
모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-프로판올 | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Axygen | 8187631104051 | |
| 15mL 원심분리기 튜브 | Greiner | 188261 | |
| 앱솔루트 에탄올 | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP 비즈 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 열 블록 | Bioer | 해당 | |
| 고감도 D1000 샘플 버퍼 | Agilent | 5067-5603 | Tapestation 고 |
| 감도 D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | Tapestation. 튜브는 별도로 판매됩니다 |
| 림포트랙 분석 키트 | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | 각각 24개의 인덱스 포함 |
| MiSeq 시약 키트 v2 (500 사이클) | Illumina | MS-102-2003 | 표준 플로우 셀 유형 및 필요한 모든 시약 포함 |
| MiSeq 시퀀서 | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR 스트립 | 4titude 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 형광측정기 | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS 어세이 키트 | Thermo Fisher | Q32854 | 완충액, 염료, 표준물질 및 특수 튜브 포함 |
| Shaker | Biosan | 해당 | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA 분리 키트 | Promega | A1120 | 세포 용해 용액, 핵 용해 용액 및 단백질 침전 버퍼가 포함됩니다 |
참고문헌
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J.....
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재인쇄 및 허가
