방법 논문

차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석

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DOI:

10.3791/61792

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2021년 1월 12일

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1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

이 논문에서

요약

현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.

초록

적응력의 특징인 면역력은 T와 B 림프구에 의해 오케스트레이션됩니다. 순환 및 상이한 장기에서는 수십억 개의 고유한 T 및 B 세포 클론이 있으며, 각각 특정 항원을 결합하여 증식, 분화 및/또는 사이토카인 분비로 이어질 수 있습니다. T와 B 세포에 있는 광대한 이질성은 다른 유전 세그먼트의 무작위 재조합에 의해 생성됩니다. 지난 10년간 개발된 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리에 대한 전례 없는 심층뷰를 가능하게 합니다. 다양한 염증 성 조건, 면역 결핍, 감염 및 악성 종양에 대한 연구는 다른 장애에서 적응 성 면역 반응의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공, 면역 레퍼토리의 복제, 유전자 사용 및 생물 학적 특성에 현저한 변화를 보여 주었다.

여기에서, 우리는 혈액과 조직에서 T와 B 세포의 면역 레퍼토리의 NGS를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 라이브러리 준비를 통해 DNA 격리에서 시작하여 NGS 시퀀서에 대한 시퀀싱및 기본 분석으로 끝나는 파이프라인을 제공합니다. 이 방법은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 특정 T 및 B 세포의 탐사를 가능하게 하고, 따라서 다른 질병에 있는 림프구 인구 및 다양성 매개변수에 있는 동적 변경을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 천천히 임상 사례를 입력하고 새로운 바이오 마커의 식별을위한 잠재력을 가지고, 위험 계층화 및 정밀 의학.

서론

T와 B 림프구로 구성된 적응형 면역 계통은 면역 학적 기억을 활용하여 이전에 만난 항원을 인식하고 신속한 반응을 시작합니다. 림프구는 골수에서 생성되고 흉선 (T 세포) 또는 골수 (B 세포)에서 성숙합니다. T 세포 수용체(TCR) 및 BCR(BCR) 둘 다 특정 항원인식을 허용하는 독특한 구성을 표시합니다. 항상성에서, T와 B 세포는 항원 제시 세포에 제시된 다른 펩티드의 수조를 끊임없이 순환하고 조사합니다. TCR 또는 BCR 결찰은 적절한 동자극과 함께, 세포 활성화로 이어지며, 그 결과 세포비콘 분비, 복제 팽창 및 항체의 생성을 초래하여 B 세포의 경우.

다른 T 또는 B 세포의 거대한 배열은 집합적으로 면역 레퍼토리라고, 다른 전형의 수많은 인식을 가능하게. 이러한 광대한 레퍼토리를 생성하기 위해, 다른 유전자 세그먼트의 임의 조립의 복잡한 과정이 발생, 독특한 항원1을결합 할 수있는 수용체의 거의 끝없는 조합을 생성. V(D)J 재조합이라고 하는 이 과정은접합부 2에서임의 삭제 및 뉴클레오티드 삽입과 함께 상이한 변수(V), 다양성(D) 및 결합(J) 유전자의 재배열을 포함한다.

적응형 면역 계통의 건축은 수십 년 동안 다른 필드에 있는 관심 있는 과학자가 있습니다. 과거에는 Sanger 시퀀싱, 보완적 결정 영역 3(CDR3) 스펙트럼, 및 유류 세포측정제가 면역 레퍼토리를 특성화하는 데 사용되었지만 낮은 해상도를 제공하였다. 지난 10년 동안 차세대 시퀀싱(NGS) 방법의 발전은 개인의 TCR 및 BCR 레퍼토리3,4의특성 과 구성에 대한 심층적인 통찰력을 가능하게 하였다. 이러한 고처리량 시스템(HTS) 서열 및 수백만 개의 재배열된 TCR 또는 BCR 제품을 동시에 처리하고 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 특정 T 및 B 세포의 고해상도 분석을 허용한다. NGS는 건강과 질병 모두에서 면역 레퍼토리를 연구하는 새로운 전략을 제공합니다. HTS를 이용한 연구는 자가면역 질환5,1차 면역결핍6,7,및 악성 종양학에서 의한 변경된 TCR 및 BCR 레퍼토리를 보여주었다8. NGS를 사용하여, 우리 및 그 외는 궤양성 대장염 및 크론병9,10,11,12,13,14를포함하여 염증성 장 질환 (IBD)을 가진 환자에서 특정 T 및 B 세포 클론의 올리고클론 확장을보여주었습니다. 전반적으로, 다른 필드에서 연구 결과는 레퍼토리에 있는 변경이 면역 매개 무질서의 병기에 있는 중요한 역할이 있다는 것을 건의합니다.

현재 프로토콜은 장 생검과 혈액에서 DNA의 격리를 위한 방법, NGS를 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, 그리고 시퀀싱 실행의 성능을 설명합니다. 우리는 또한 면역 레퍼토리 데이터 분석의 기본 단계를 제공합니다. 이 프로토콜은 TCRα, TCRγ 및 IGL 라이브러리의 생성에도 적용될 수 있다. 이 방법은 조직별 소화 프로토콜이 사용되는 한 다른 장기(예: 림프절, 종양, 활액, 지방 조직 등)와도 호환됩니다.

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프로토콜

이 연구는 셰바 의료 센터의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 모든 참여 과목에서 서면 동의를 얻었습니다.

1. DNA 격리 및 정량화

  1. 장생검의 소화 및 세포 용해
    1. 새로 수집하거나 -20 °C 또는 -80 ° C에 저장된 장 생검을 검색하십시오. 냉동 생검을 사용하는 경우, 얼음에 해동.
    2. 얼음 에 차가운 멸균 1.7 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 핵 용해 용액 600 μL을 추가합니다.
    3. 용액이 있는 마이크로센심분리기 튜브에 생검을 넣고 65°C에서 15-30분 동안 배양합니다.
    4. 20 mg / mL 단백질 Ae K의 17.5 μL을 추가하고 부드러운 흔들림과 함께 55 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    5. 1.3단계로 진행하기 전에 샘플을 실온까지 5분 동안 식힙니다.
  2. 전혈의 세포 리시스
    1. EDTA, 헤파린 또는 구산염 함유 튜브에서 3mL의 전혈을 얻습니다.
    2. 철저히 혼합될 때까지 부드럽게 암투하고, 9mL의 세포 용액을 함유한 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 혈액을 전달합니다. 실온에서 10 분 잠복기 동안 여러 번 반전하십시오.
    3. 실온에서 10 분 동안 2,000 x g의 원심 분리기다음 보이는 흰색 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 폐기하십시오. 잔류 액의 약 50-100 μL이 유지됩니다.
    4. 소용돌이 튜브는 완전히 다시 중단 될 때까지 15 초 동안 적극적으로. 핵 용해 용액 3mL을 여러 번 넣고 파이펫을 여러 번 넣습니다. 용액은 점성이 되어야 합니다.
  3. 단백질 강수량
    1. 조직에 단백질 강수 완충제 의 200 μL, 또는 혈액에 1 mL를 추가합니다. 소용돌이는 20 초 동안 적극적으로 얼음에 5 분 동안 배양합니다. 작은 단백질 덩어리는 소용돌이 후에 보일 수 있습니다.
    2. 원심분리기 16,000 x g에서 4분 동안. 침전된 단백질을 포함하는 단단한 펠릿은 형성되어야 합니다.
    3. 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.7 mL 튜브로 조심스럽게 체계를 전송합니다.
      참고: 펠릿이 단단하지 않은 경우 4분 동안 16,000 x g의 또 다른 원심분리기를 고려하십시오.
  4. DNA 강수량 및 수분 공급
    1. 상체가 들어있는 튜브에 2 프로판놀 1 mL을 넣고 반전하여 부드럽게 섞습니다. DNA는 백색 부동 물질로 보일 것입니다.
    2. 원심 분리기 16,000 x g에서 1 분 동안. 파이펫을 사용하여 상체를 완전히 제거합니다.
    3. 갓 준비된 70% 에탄올 1mL을 넣고 튜브를 여러 번 반전시다. 원심분리기는 실온에서 1분 동안 16,000 x g의 원심분리기. 주체를 신중하게 폐기하십시오.
    4. 반복 단계 1.4.3.
    5. 깨끗한 흡수성 용지에 10-15분 동안 개방형 튜브를 뒤집어 놓습니다. 튜브를 다시 반전하고 완전한 수분을 확인합니다. 필요한 경우 10-15분 동안 공기 건조상태로 둡니다.
      참고 : 펠릿이 완전히 건조하는 것이 중요합니다.
    6. 초순수(UPW)의 50μL를 추가합니다. 필요한 경우, DNA는 정량화 후에 더 희석될 수 있습니다.
    7. 65°C의 열 블록에서 1시간 동안 배양하여 DNA 재수화를 합니다.
  5. DNA 정량화
    참고: DNA는 재료 표에 명시된 바와 같이 형광계 및 지정된 시약을 사용하여 정량화되었다.
    1. 실온에 표준을 가져오고 0.5mL 지정 튜브를 포함하여 키트를 준비하십시오.
    2. 샘플 수에 따라 15mL 튜브에서 버퍼 및 염료 믹스를 준비합니다. 200μL의 버퍼와 시료당 1μL의 염료를 추가합니다. 표준에 대한 2개의 샘플을 포함합니다. 버퍼가 충분하지 않도록 추가 샘플을 계산하는 것이 좋습니다.
      1. 2 기준의 경우, 위에서 준비한 혼합물의 190 μL을 0.5mL 튜브에 놓습니다. 표준의 10 μL을 추가합니다.
      2. 각 샘플에 대해, 위에서 준비한 혼합물의 199 μL을 0.5 mL 튜브에 놓습니다. DNA의 1 μL을 추가합니다.
    3. 샘플을 읽습니다. 결과는 견본의 DNA 농도를 나타냅니다.
    4. 샘플이 한계를 초과하는 경우 UPW로 DNA 1:10을 희석하고 읽기를 반복합니다.

2. 도서관 준비

참고: 현재 프로토콜은 NGS 시퀀서와 호환되는 멀티플렉스 PCR 기반 분석 키트를 활용합니다. 이 키트에는 Vβ 및 Jβ 지역 내의 보존 지역을 대상으로 각 24개의 서로 다른 인덱스가 포함되어 있습니다. 이를 통해 1단계 PCR 반응과 다양한 샘플의 풀링이 가능합니다. 자세한 내용은 재료 테이블을 참조하십시오.

  1. DNA 샘플을 준비합니다. DNA 150ng을 얻고 총 5 μL에 UPW를 추가합니다.
    참고: 최소 농도가 10ng/μL인 라이브러리 준비를 위해 DNA의 150ng 미만을 사용할 수 있습니다.
  2. 파이펫과 팁을 UV 조명으로 후드에 15분 동안 배치하여 잔류 DNA를 분해합니다. 한편, 다른 인덱스 튜브 (도서관 준비를 위해) 및 DNA 폴리머라제얼음에 해동할 수 있도록 합니다.
  3. 생물학적 후드에서, PCR 튜브에 다른 인덱스 튜브에서 45 μL을 추가합니다. 다음, DNA 폴리머라제의 0.2 μL과 PCR 튜브에 2.1 단계에서 제조된 DNA의 5 μL을 추가한다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 미리 설정된 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 실행합니다.

3. 앰플리코 정제 및 정량화

  1. 과도한 프라이머, 뉴클레오티드 및 효소를 제거하기 위해 마그네틱 구슬을 사용합니다.
    1. 구슬을 실온으로 최소 30분 이상 데우기. 샘플 당 400 μL에 대해 신선한 80 % 에탄올을 충분히 준비하십시오.
    2. 각 PCR 튜브에 구슬의 50 μL(IGH) 또는 35 μL(TCRβ)을 넣고 10번 배로 하여 섞는다. 실온에서 10분 동안 배양하십시오.
    3. 혼합 샘플을 자기 스탠드에 5분 동안 놓습니다.
    4. 투명 액체의 흡인 95 μL (IGH) 또는 80 μL (TCRβ) 및 폐기. 10 μL 팁을 사용하여 남은 액체를 흡인합니다.
    5. 각 샘플에 80% 에탄올의 200 μL을 추가합니다. 인큐베이션 30 s. 에탄올 의 195 μL을 흡인하고 폐기하십시오. 10 μL 팁을 사용하여 남은 액체를 흡인합니다.
    6. 3.1.5 단계를 반복합니다. 튜브의 캡을 열고 공기가 5 분 동안 건조하게하십시오.
    7. 5분 직후, 자기 스탠드에서 제거하고 용출 버퍼의 25 μL을 추가하십시오(10mM Tris-HCl, pH 8.0). 균일할 때까지 파이펫팅으로 섞는다. 실온에서 2분 동안 배양하십시오.
    8. 5 분 동안 자기 스탠드에 튜브를 배치합니다. 22 μL을 새로운 PCR 튜브로 옮기십시오. DNA 농도를 측정합니다(1.5단계).
  2. 앰플리코 정량화
    참고: 현재 프로토콜은 DNA 농도, 크기 및 무결성의 품질 관리를 위해 자동화된 전기 전광 기계를 사용합니다. 자세한 내용은 재료 테이블을 참조하십시오.
    1. 시약과 스크린테이프를 실온에 30분 이상 놓습니다.
    2. 새로운 1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브에서, 3.1.8 단계에서 정량화된 DNA 샘플의 1 ng/μL 희석을 UPW로 3 μL 이상의 총 부피를 만듭니다.
    3. 소용돌이는 사용하기 전에 DNA를 희석시켰습니다. 미리 표지된 전문 PCR 스트립(키트에 제공)에 희석 된 DNA의 2 μL과 함께 버퍼 2 μL을 배치하고 캡을 놓습니다. 셰이커에 1분 간 놓고 PCR 스트립을 회전시합니다.
      참고: 버퍼의 점도로 인해 샘플 튜브로 전송하기 전에 팁에서 초과 버퍼가 제거되었는지 확인합니다.
    4. 뚜껑없이 기계, 스크린 테이프 및 PCR 스트립에 배치합니다. 기기 내부의 팁 박스 뚜껑을 엽니다. 적절한 레이블로 위치를 할당합니다. 기기를 시작합니다.
      참고: 출력 히스토그램은 앰플리턴(그림1A)의원하는 크기에서 단일 피크여야 합니다. 품질이 좋지 못한 샘플에서는 비드 청소 또는 프라이머 디머 형성을 나타내는 추가피크(그림 1B)가관찰됩니다.

4. 차세대 시퀀싱

  1. 라이브러리의 정량화 및 풀링
    1. nM에서 최종 DNA 농도를 계산하여 3.1.8 단계로부터의 DNA 값을 사용하고, 전기 전도 기계 결과로부터 얻은 제품 피크의 기본 쌍(bp)의 크기(그림 1참조).
    2. 각 샘플에 대해, 10-20 μL 용출 버퍼의 최종 부피에서 4 nM의 최종 농도를 취할 DNA 부피를 계산합니다.
    3. 각 샘플에 대해 새로운 희석 믹스를 준비하고 2 μL을 새로운 풀 믹스로 가져 가라.
      참고: 4nM 미만의 샘플의 경우 가능한 최대 샘플 양을 추가합니다.
  2. 라이브러리의 NGS 실행
    참고: 현재 프로토콜은 벤치탑 시퀀서 플랫폼을 사용합니다. 자세한 내용은 재료 테이블을 참조하십시오.
    1. 0.2 N NaOH의 새로운 솔루션을 준비하십시오. 4.1.3 단계에서 준비된 희석된 라이브러리에 0.2 N NaOH의 10 μL을 추가합니다. 튜브와 소용돌이에 5%의 PhiX를 간략하게 추가합니다. 모든 솔루션이 튜브 의 바닥에 정착했는지 확인하기 위해 튜브를 아래로 회전합니다.
    2. 이중 좌초 된 DNA를 변성하기 위해 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 키트에서 DNA와 소용돌이가 들어있는 튜브에 980 μL의 미리 차가운 버퍼를 간략하게 추가합니다.
    3. 희석된 라이브러리를 얼음 위에 놓고 다음과 같이 도서관을 준비합니다. 17 pM의 혼합을 위해, 완충제의 단계 4.2.2 및 575 μL에서 DNA의 425 μL을 추가합니다. 라이브러리를 여러 번 반전시키고 회전합니다. 최종 라이브러리의 600 μL을 지정된 카트리지에 로드하고 샘플을 컴퓨터에 배치합니다.
    4. 소프트웨어 지침에 따라 실행을 시작합니다.

5. 시퀀싱 분석

  1. 시퀀서에서 시퀀싱 메트릭을 다운로드하고 시퀀싱 데이터가 다음 범위 내에 있는지 확인합니다(현재 프로토콜에 사용되는 키트에 대한 특정). 이러한 기준을 충족하지 않는 샘플은 반복 실행의 대상이 됩니다.
    클러스터 밀도(밀도(K/mm2): 945K - 1800K
    필터 통과(클러스터 PF(%)를 읽는 읽기의 퍼센트): >90%
    품질 점수(%>=Q30): >85%
    PhiX 정렬 (정렬 %): 1.5% - 10%
    PhiX 오류율(%): <1.0%

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결과

본명, 장 조직 및 혈액으로부터의 DNA 절연 방법, NGS용 라이브러리 준비, 면역 레퍼토리 시퀀싱을 위한 시퀀싱 실행의 기본 단계를 설명한다. 이 실행은 국제 ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST 플랫폼에서 사용하기 위해 fasta 파일로 추가 변환 할 수있는 fastq 파일을 생성합니다. 이 HTS는 뉴클레오티드 레벨15에서수만 개의 재배열된 TCRβ 및 IGH 서열의 많은 분석을 수행하고 관리한다. IMGT/HighV-QUEST를 사용하면 건강과 질병 모두에서 다양한 TCR 및 IGH 레퍼토리를 분석할 수 있습니다. 이것은 새로운 "질병 특정" 클론의 식별, 복제 확장 및 다양성 매개 변수의 분석, 차동 V (D)J 사용의 묘사, 체세포 하이퍼 돌연변이의 분석 및 더 많은 것으로 이어질 수 있습니다. IMGT/HighV-QUEST는 특정 시퀀스와 풍부한 순서를 포함하는 CSV 파일을 제공합니다. 게놈 DNA를 시작 재료로 사용하면 세포 수를 대표하는 서열 ...

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토론

B와 T 림프구의 풍부함과 기능의 변화는 종종 다른악성(18),만성 염증장애(예를 들어, 궤양성 대장염 및 류마티스 관절염)10,19,및 다양한 면역결핍(17,20)에서종종 발생한다. 현재 방법은 NGS를 활용하여 TCR 및 BCR 레퍼토리의 심층적 시각을 용이하게 하여 T 및 B 세포 클론의 미묘한 변화, 클론 공유, V(D)J 유전자 사용 및 B 세포의 경우 체세포 하이퍼 돌연변이의 정도에 대한 정보를 가능하게 합니다.

DNA 격리 방법은 장 생검 및 혈액 샘플을 위해 기술되었다. 그러나, 리시스 및 DNA 추출의 수정으로, 방법은 종양, 림프절, 활액 등과 같은 그밖 조직에 적용될 수 있습니다. 라이브러리 준비 중에 다른 프...

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공개 사항

모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-프로판올SigmaI9516-500ML
1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브Axygen8187631104051
15mL 원심분리기 튜브Greiner188261
앱솔루트 에탄올Merck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP 비즈Beckman CoulterA63881
열 블록Bioer해당
고감도 D1000 샘플 버퍼Agilent5067-5603Tapestation 고
감도 D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584Tapestation. 튜브는 별도로 판매됩니다
림포트랙 분석 키트InvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019각각 24개의 인덱스 포함
MiSeq 시약 키트 v2 (500 사이클)IlluminaMS-102-2003표준 플로우 셀 유형 및 필요한 모든 시약 포함
MiSeq 시퀀서IlluminaSY-410-1003
PCR 스트립4titude 4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 형광측정기Thermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS 어세이 키트Thermo FisherQ32854완충액, 염료, 표준물질 및 특수 튜브 포함
ShakerBiosan해당
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra pure waterBio-lab7501
Wizard DNA 분리 키트PromegaA1120세포 용해 용액, 핵 용해 용액 및 단백질 침전 버퍼가 포함됩니다
없음없음에는 .

참고문헌

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