실험적 자가면역 포도막염: 안구내 염증성 마우스 모델

요약

이 보고서에서 우리는 조사자가 안내 포도막염의 마우스 모델을 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 더 일반적으로 실험적 자가면역 포도막염(EAU)이라고 하는 이 확립된 모델은 인간 질병의 여러 측면을 포착합니다. 여기에서는 여러 판독값을 사용하여 질병 진행을 유도하고 모니터링하는 방법을 설명합니다.

초록

실험적 자가면역 포도막염(EAU)은 자가 항원에 반응하는 면역 세포에 의해 유발됩니다. 이 비 전염성, 안내 염증 질환 모델의 많은 특징은 인간에게 영향을 미치는 후 포도막염의 임상 표현형을 요약합니다. EAU는 새로운 염증 치료제의 효능, 작용 방식을 연구하고 안내 질환의 질병 진행을 뒷받침하는 메커니즘을 추가로 조사하는 데 안정적으로 사용되었습니다. 여기에서는 이 질병에 취약한 가장 널리 사용되는 모델 유기체인 C57BL/6J 마우스의 EAU 유도에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 질병 중증도 및 진행의 임상 적 평가는 안저 내시경 검사, 조직 학적 검사 및 fluorescein 혈관 조영술을 사용하여 입증됩니다. 유도 절차는 안구 단백질 광수용체 레티노이드 결합 단백질(레티놀 결합 단백질 3이라고도 함), 완전 프로인트 보조제(CFA)로부터 펩티드(IRBP_1-20)를 함유하는 에멀젼을 피하 주사하고 사멸된 결핵균을 보충하는 것을 포함합니다 . 이 점성 에멀젼을 목 뒤쪽에 주사 한 다음 Bordetella 백일해 독소를 복강 내 주사합니다. 증상이 시작될 때(12-14일) 전신 마취 상태에서 임상 검사를 통해 질병 진행을 평가하기 위해 안저경 이미지를 촬영합니다. 이러한 데이터는 차이를 분석하여 후기 시점 및 피크 질병 (20-22 일)의 데이터와 직접 비교할 수 있습니다. 동시에,이 프로토콜을 통해 조사자는 fluorescein 혈관 조영술을 사용하여 혈관 투과성 및 손상의 잠재적 차이를 평가할 수 있습니다. EAU는 야생형 또는 유전자 변형 된 다른 마우스 균주에서 유도 될 수 있으며 약물 효능 및 / 또는 질병 메커니즘을 연구하기위한 유연성을 제공하는 새로운 치료법과 결합 될 수 있습니다.

서론

이 프로토콜은 유화된 보조제에 망막 항원을 단일 피하 주사하여 C57BL/6J 마우스에서 실험적 자가면역 포도막염(EAU)을 유도하는 방법을 보여줍니다. 질병 진행을 모니터링하고 평가하는 방법은 안저 내시경 영상 및 조직 검사를 통해 자세히 설명되며 측정 매개 변수가 요약되어 있습니다. 또한, 망막 혈관 구조 및 투과성을 검사하는 기술인 플루오레세인 혈관조영술에 대해서도 논의할 것이다.

이 EAU 모델은 임상 병리학 적 특성과 질병을 유발하는 기본 세포 및 분자 메커니즘과 관련하여 인간의 비 감염성 후방 포도막염의 중심 특징을 요약합니다. EAU는 입양 이식 실험 및 IFNγ-고갈 마우스¹에서 나타낸 바와 같이, 자가 반응성 CD4⁺T 림프구의 Th1 및/또는 Th17 서브세트에 의해 매개된다. 포도막염에서 이러한 세포의 잠재적 역할에 대한 우리의 이해의 대부분은 망막 조직 내에서 Th1 및 Th17 세포가 모두 검출되는 EAU²를 연구하는 데서 비롯^됩니다3. 종종 EAU는 질병을 약화시키는 새로운 치료법의 유용성을 평가하기위한 전임상 모델로 사용됩니다. EAU 질병을 성공적으로 조절한 치료 접근법은 클리닉에서 일부 효능을 보였고 FDA 승인 상태에 도달했습니다. 이들의 예는 T 세포 표적화 요법과 같은 면역조절 약물의 그룹이다: 사이클로스포린, FK-506, 및 라파마이신 ^4,5,6. 최근에는 질병 결과에 대한 메커니즘과 효과를 모두 조사하기 위해이 모델에서 새로운 경로를 목표로하는 중재도 탐구되었습니다. 여기에는 염색질 판독기 브로모도메인 엑스트라 말단(BET) 단백질 및 P-TEFb 억제제³를 통한 전사 조절을 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 더욱이, VLA-4 억제제와 같은 보다 통상적인 접근법은 최근 이펙터 CD4⁺ T 세포⁷의 조절을 통해 EAU에서 억제를 입증하였다. 또한, RORγt 역작용제인 TMP778로 Th17 세포를 표적화하는 것도 EAU⁸을 유의하게 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 모델은 망막의 만성 자가면역 염증 및 림프구 프라이밍과 같은 수반되는 기본 메커니즘을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.

EAU 전임상 연구의 주요 판독은 망막 안저경 영상을 수행하여 임상 평가하고 덜 자주 광학 간섭 단층 촬영(OCT)으로 망막 무결성을 평가하는 것입니다. 유세포 분석에 의한 망막 조직 병리학 적 평가 및 망막 세포의 면역 표현형은 종결시 수행됩니다. Fundoscopy는 전체 망막의 신속하고 재현 가능한 임상 평가를 가능하게하는 사용하기 쉬운 라이브 이미징 시스템입니다. 면역 조직 화학적 평가의 경우,이 기술은 염증 및 구조적 손상 정도에 대한 조직 구조를 연구 할 수있는 망막 절편의 준비를 기반으로합니다⁹. 사용 된 모든 기술에 대한 평가 기준 및 기존 채점 시스템은이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 안저 영상을 사용하여 기록 된 손상 정도는 종종 조직 학적 변화와 밀접한 관련이 있습니다. 질병 중증도를 모니터링하고 평가하는 이러한 이중 접근 방식은 더 높은 감도와 더 신뢰할 수 있는 측정 결과를 제공합니다.

EAU는 면역 매개 안 질환의 전임상 테스트 및 조사를 위해 잘 확립되고 일반적으로 사용되는 모델입니다. 이 모델은 >95%의 질병 발생률로 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 전 세계적으로 근로 연령 실명의 주요 원인을 나타내는 안구 내 염증성 질환 치료를 위한 새로운 치료법을 검증하거나 거부하는 데 사용할 수 있는 포괄적인 데이터를 생성합니다¹⁰.

프로토콜

모든 실험은 1986 년 영국 동물 (과학적 절차) 법 및 기관 동물 복지 및 윤리 검토기구 (AWERB) 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 하우징 C57BL/6J 마우스

1. 특정 병원체가 없는 환경에서 하우스 마우스, 12시간의 명암주기 및 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다.
2. 성인 여성 C57BL / 6J에 대한 모든 실험을 수행하십시오 (포도막염 환자에서 여성과 남성의 발병률이 1.4 대 1이므로 여성이 우선적으로 선택됩니다). 암컷 C57BL/6J 마우스를 체중과 연령별로 6-8주 사이에 무작위로 배정합니다. 마우스를 케이지 당 5-6 마리의 마우스 그룹으로 개별 환기 케이지 (IVC)에 수용합니다.

2. C57BL/6 마우스의 예방 접종

1. IRBP_{1-20 -} CFA 에멀젼 제제
   참고: 에멀젼 제제는 질병의 재현성과 발병률에 필수적입니다. 따라서 준비 과정과 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하기 위해 모든 노력을 기울여야 합니다. 에멀젼을 준비 할 때 사전에 모든 시약의 계산에서 손실을 고려해야합니다. 이 손실은 예방 접종을 위해 계획된 마우스의 수를 기준으로 약 1.5배(또는 준비된 부피의 50% 추가)일 수 있습니다. 아래의 다음 예를 참조하십시오. 10 마리의 마우스를 면역화하려면 15 마리의 마우스를 준비하고 400 μg (마우스 20g 당 펩타이드) x 15 마우스 = 6mg을 사용하십시오. 각 마우스는 예방 접종을 위해 200μL를 받아야 합니다(총 3mL). 최종 부피는 펩타이드 용액과 CFA의 1:1 비율로 구성되므로 펩타이드 용액 1.5mL와 CFA 1.5mL가 됩니다.
   1. 무균 기술을 사용하여 층류 캐비닛에서 모든 멸균 용액을 준비하십시오.
   2. 인간 IRBP_1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) 동결건조 펩타이드의 원하는 양(마우스 20g 당 400μg)을 칭량합니다. 펩타이드를 100% DMSO에 용해시킨다. -20°C에서 동결건조된 형태로 재고를 저장합니다.
      알림: 분말이 완전히 용해되었는지 확인하려면 각 플레이크가 먼저 DMSO와 접촉해야하며 잔류 고체의 흔적이 없어야합니다. PBS를 작은 부분으로 추가하여 최종 볼륨에 도달합니다. 와류와 혼합하지 말고 대신 피펫으로 부드럽게 교반하십시오. DMSO의 최종 농도는 총 펩타이드 제제 부피의 1%를 초과해서는 안 된다. 테이퍼 진 바닥이있는 20mL 플라스틱 튜브에서 에멀젼을 준비하면 동결 건조 된 분말에 DMSO를보다 잘 접근 할 수 있습니다.
   3. DMSO-PBS 펩타이드 용액을 1:1 v/v로 이미 1.5 mg/mL 사멸된 결핵 균이 보충된 CFA에 추가하여 최종 농도 2.5mg/mL를 제공합니다. 점성이 있고 고르게 분포된 에멀젼을 형성하기 위해 부드럽고 자주 피펫팅하여 적가합니다.
   4. 1000 μL 피펫(추가 손실을 방지하기 위해 700 μL로 설정)과 피펫을 사용하여 펩타이드 용액과 CFA를 폭기하여 크림처럼 두꺼운 농도를 생성합니다. 이 기술은 피펫을 사용하여 원하는 두께에 도달 할 때까지 위아래로 반복적으로 흡인하는 것을 포함합니다. 최적의 결과를 얻으려면 주입하기 전에 항원 용액과 보조제가 완전히 혼합되었는지 확인하십시오.
2. 백일해 독소의 복강 주사
   1. 1.5 μg 보르데텔라 백일해 독소를 1% 마우스 혈청이 보충된 100 μL의 RPMI 1640 배지에 현탁합니다¹¹.
   2. 멸균 주사기와 23G 바늘로 i.p. 주사를 수행하십시오.
      알림: 주사 부위의 교란을 피하기 위해 항원을 주사하기 전에 백일해 독소를 투여해야 합니다.
   3. 각 마우스를 일시적으로 별도의 케이지로 옮겨 Bordetella 백일해 독소의 단일 100 μL i.p. 주사를 받습니다.
3. IRBP 에멀젼의 피하 주사
   1. 다음으로, IRBP 에멀젼을 피하에 주입한다. 이 과정에는 건강 및 안전 규정에 따라 적절하게 보호 복장을 한 두 명의 동물 취급자가 필요합니다.
   2. 훈련된 사람 한 명이 배가 아래를 향하도록 하고 다른 훈련된 사람이 피부를 꼬집어 목 뒤쪽에 텐트와 같은 구조를 형성하여 손가락과 엄지 손가락 사이에 바늘을 삽입할 수 있는 긁힌 자세로 케이지 위에 마우스를 가볍게 제지하게 합니다.
      주의 : 바늘에 찔려 부상을 입을 위험이 있습니다.
   3. 바늘이 배치되면 IRBP 에멀젼 200μL를 주입합니다. 바늘을 제거 할 때 바늘 머리를 돌려 피부를 닫은 후 꺼내고 나중에 주사 부위에 압력을 가하여 에멀젼의 역류를 방지하십시오.
      주의 : 에멀젼은 자극을 유발할 수 있고 더 심한 경우 병변이 발생할 수 있으므로 마우스 피부 나 털에 접촉해서는 안됩니다. 이런 일이 발생하면 70 % 에탄올을 사용하여 즉시 완전히 닦은 다음 건조시켜야합니다.
      알림: 연구가 끝날 때 검사를 위해 배액 림프절이 필요한 경우 주사 부위가 달라집니다. 이 경우 측면의 양쪽에 100μL를 피하 주사하십시오. 이것은 수확시 절제 될 수있는 배수 사타구니 림프절에서 더 강한 반응을 생성합니다. 그러나 의도 된 결과가 EAU를 개발하는 것이라면 목 뒤쪽에 200μL를 한 번 주사하여 여러 주사 부위의 불편 함을 피하는 것이 좋습니다.

3. 임상 평가 - 마우스 안저 검사

참고: 임상 질환은 안저 검사를 사용하여 채점해야 하며, 안저경을 사용한 명시야 라이브 이미징과 시각화에 사용되는 Discover 소프트웨어를 통해 점수를 매겨야 합니다.

1. 질병 발병 (12-14 일)에 케타민 (50 mg / mL)과 도미 토르 (Medetomidine; 1 mg / mL)의 조합을 사용하여 전신 마취하에 마우스를 진정시켰다. 희석 1 부분 도미 터; 케타민 1.5 부와 멸균 주사 가능한 물 2.5 부를 복강 내 주사 한 다음 30g 당 100μL를 복강 내 주사한다. 위의 마취 조합에는 1mL 멸균 주사기와 23G 바늘을 사용하십시오.
2. 그런 다음 마우스를 모니터링하여 모든 반사 신경이 손실되고 자극에 반응하지 않는지 확인하십시오.
3. i.p. 주사를 맞은 직후 마우스가 여전히 긁힌 채로 있는 동안 동공 확장을 위해 각 눈에 1% 트로피아미드와 2.5% 페닐에프린을 국소적으로 적용합니다. 두 확장 용액으로 각막을 완전히 덮는 것을 목표로하십시오. 동공이 완전히 확장되기까지 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
4. 그 후, 눈 점성 연고에 넉넉하게 바르고 이미징 과정 전반에 걸쳐 유지하여 눈을 완전히 윤활하고 수분을 유지하십시오.
5. 그 동안 소프트웨어(예: Discover)를 열고 명시야 아래에서 이미지를 캡처하도록 안저경(예: Micron)을 설정합니다. 각 개별 마우스에 폴더를 할당하고 촬영한 각 눈에 따라 R 또는 L로 이미지에 레이블을 지정합니다.
6. 실시간 시각화를 위해 특별히 제작된 스테이지에 마우스를 장착하고 망막에 완전히 접근할 수 있도록 현미경을 배치합니다.
7. 질병을 정확하게 표현하려면 시신경 디스크 외에도 주변의 모든 구석을 덮는 전체 망막 영역의 이미지를 촬영하십시오. 이를 위해서는 접안 렌즈를 전체적으로 조정하십시오. 이미징 과정 전반에 걸쳐 눈이 항상 완전히 윤활된 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 일정한 속도로 눈 연고를 토핑하여이를 확인하십시오.
8. 이 단계에서 섹션 4 (아래)를 참조하여 fluorescein 혈관 조영술을 수행하십시오.
9. 모든 영상이 완료되면 주사 가능한 물에 마취 역전 항진정제(5mg/mL 항진정제)를 희석하고 0.1mg/kg i.p.로 투여합니다. 마우스를 케이지에 다시 넣고 회복 될 때까지 젖은 젖은 식단에 접근 할 수있는 예열 된 매트에 놓습니다. 완전한 회복은 전신 움직임과 꾸준한 걸음걸이로 케이지 주위를 걷는 것이 특징이며 일반적으로 몇 시간이 걸립니다.
10. 지정된 실험 종점(예: 21-23일)에서 4.1-4.5단계를 반복하고 전체 망막 영역의 사진을 다시 찍어 시신경 디스크와 주변의 모든 모서리를 덮어 질병의 정확한 표현을 캡처합니다.

4. 플루오레세인 혈관조영술

1. 이 동물들의 혈관 누출을 측정하려면 마취 상태에서 각 마우스에게 목 뒤쪽에 2 % fluorescein을 피하 주사하고 망막이 살아있는 이미지의 중앙에 집중되도록 위치시킵니다.
2. 안저경을 465-490nm의 청색광 여기 필터로 설정합니다. 여기 된 플루오레 세인으로부터 포착 된 빛은 520-530 nm입니다.
3. 플루오레세인 주사 후 1.5분 후, 각 망막의 사진을 찍고 7분에 다시 반복한다.
   참고: 타이밍은 이러한 이벤트에 매우 중요하며, 둘 다 캡처할 수 없는 경우 한쪽 눈만 이미지화하십시오.

5. 임상 질병 점수 매기기

1. 임상 평가는 다음 기준의 중증도를 기반으로 합니다: 시신경 디스크 염증, 망막 혈관 커핑, 망막 조직 침윤 및 구조적 손상.
2. 이러한 각 매개 변수에 0에서 5까지의 척도로 점수를 부여하고 총체적 총계는 전체 눈에 대한 임상 질환을 대표하며 눈당 최대 20 점을 얻을 수 있습니다. 표 1 은 채점 기준에 대한 지침으로 사용할 수 있습니다.

6. 조직학 및 조직학적 점수 매기기

1. 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사 한 후, 눈 전체에 쉽게 접근 할 수 있도록 눈꺼풀을 벌려 눈을 핵을 제거합니다.
2. 다음으로, 안와 결합 조직과 시신경을 잡기 위해 구부러진 집게를 지구 뒤에 놓습니다. 지구를 쥐어 짜지 않도록주의하십시오.
3. 고정을 위해 망막 박리를 최소화하기 위해 최소 15분 동안 눈을 4% 글루타르알데히드에 넣은 다음 최소 24시간 동안 10% 포름알데히드로 옮깁니다. 1-2mL의 정착액은 두 눈을 덮을 수 있는 충분한 부피를 제공합니다.
4. 파라핀에 매립하고, 마이크로톰에 절편하고, 표준 프로토콜에 따라 염색을 수행합니다. 3-4 μm 단면 두께는 모든 유형의 염색에 권장됩니다.
5. Hematoxylin 및 Eosin (H & E) 염색을위한 표준 프로토콜을 사용하여 눈의 조직 학적 검사를 수행합니다.
6. 망막 및 맥락막 내 면역 세포 침윤 정도, 망막층의 파괴, 육아종 형성 정도 및 망막 박리 정도를 기준으로 EAU 점수 기준에 따라 0-4의 척도로 점수를 할당하고, 앞서 설명한 바와 같이 망막 손상을 나타내며(Agarwal 2013) 표 2¹¹에 요약했습니다.

결과

이 프로토콜에서, 우리는 IRBP로부터 유래된 포도막성 망막 펩티드로 마우스를 면역화함으로써 실험적 자가면역 포도막염(EAU)의 모델을 유도하기 위한 단계별 방법을 설명한다. 널리 사용되고 쉽게 접근 할 수있는 접근법을 사용하는 질병의 평가는 독점적이지 않으며 다른 영상 기술에 추가되거나 부분적으로 대체 될 수 있지만 다루어집니다. C57BL/6J 마우스에서 EAU의 첫 징후는 그림 1과 같이 면역화 2주 후 3주 이내에 피크 질환에 도달하여 검출될 수 있습니다. 안저경 변화는 질병 진행 중 침윤 면역 세포 및 구조적 손상에 따른 조직학적 변화 외에도 망막 조직, 혈관 및 시신경 디스크 염증, 망막 구조 손상(그림 2)을 포함하는 염증 변화로 분류됩니다. 이러한 임상적 및 조직병리학적 변화는 면역화 후 최대 85일 동안 검출될 수 있고, 평가를 위해 등급화 및 스코어링되어 질환 진행을 연구할 것을 제안한다. 질적 시각적 채...

토론

실험 동물 모델은 질병 발병기전을 연구하고 새로운 치료 패러다임의 전임상 테스트를 수행하는 데 필요한 도구입니다. 현재 프로토콜에서는 안내 염증성 포도막염의 실험 모델 인 EAU를 유도, 모니터링 및 채점하는 방법론에 대해 논의했습니다. 이 EAU 모델은 모든 절차가 본원에 요약된 프로토콜에 따라 수행될 때 95% 이상의 질병 발생률을 가지며, 만성, 단상 EAU의 발달을 초래한다. 이 발병 수준을 달성하기 위해 우리는 항원 준비와 에멀젼 주입의 중요성을 강조하며, 둘 다 위에 자세히 설명되어 있습니다. 동물에서 EAU의 주요 특징은 망막 및/또는 맥락막 염증, 망막 혈관염, 광수용체 파괴 및 시력 상실이며, 이들 모두는 인간 후방 포도막염의 많은 필수 임상병리학적 특징을 나타냅니다¹². 포도막염에 관여하는 기본적인 세포 및 분자 메카니즘의 이해의 대부분은 본원에 기재된 바와 같은 유도된 EAU 모델로부터 유래된다. EAU는 림프구에 의해 인식되는 망막 항원을 사용한 활성 면역화에 의해...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Antisedan	ZOETIS, Complete	깨우기 위한
s 보조제; CFA	Sigma, 영국	F5881	면역
Domitor	Orion Pharma, 핀란드		마취
Flourescein	Sigma, 영국	F2456	혈관 조영
IRBP1-20	Chamberidge 펩티드, 영국		펩타이드; 항원
케타민	오리온 제약, 핀란드		마취
마이크론 III	피닉스 리서치, 미국		안저 검사,
마우스 혈청	시그마, 영국	M5905	면역
Mycobacterium terberculosis	Sigma, 영국	344289	면역
백일해 독소	시그마, 영국	P2980	면역
페닐에프린 하이드로클로라이드 2.5%	바우쉬 & 롬 영국	PHEN25
트로피카미드 1%	SANDOZ
Viscotears	WELDRICKS Pharmacy, 영국		눈 윤활 2082642