방법 논문

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

DOI:

10.3791/61843

⸱

2020년 10월 29일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

바이러스의 동적 복제 및 조립 프로세스를 캡처하는 것은 바이러스 핵산 및 단백질의 민감하고 동시 표지를 가능하게 하는 강력한 현장 혼성화(ISH) 기술의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 기존의 DNA 형광 제자리 혼성화(FISH) 방법은 종종 면역염색과 호환되지 않습니다. 따라서 우리는 DNA, RNA 및 단백질의 동시 단일 세포 시각화를 가능하게하는 이미징 접근법 인 MICDDRP (DNA, R NA 및 protein의 궁극적 인 형광 c ell 기반dtection)를 개발했습니다. 기존의 DNA FISH와 비교하여 MICDRP는 분지 DNA(bDNA) ISH 기술을 활용하여 올리고뉴클레오티드 프로브 감도와 검출을 크게 향상시킵니다. MICDDRP의 작은 변형은 다른 가닥의 핵산 (RNA 또는 DNA)과 함께 바이러스 단백질의 이미징을 가능하게합니다. 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1, 인간 T- 림프 트로픽 바이러스 (HTLV) -1, B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 지카 바이러스 (ZKV) 및 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)를 포함한 여러 바이러스 병원체의 수명주기를 연구하기 위해 이러한 프로토콜을 적용했습니다. 우리는 다양한 범위의 바이러스에 걸쳐 바이러스 핵산과 단백질을 효율적으로 라벨링할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 연구는 여러 바이러스 시스템에 대한 향상된 기계론적 이해를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 광범위한 세포 시스템에 걸쳐 DNA, RNA 및 단백질의 다중 형광 이미징을 적용하기 위한 템플릿 역할을 할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기존의 면역염색 접근법을 통해 수천 개의 상용 항체를 사용하여 단백질을 특이적으로 표지할 수 있고, 융합 단백질은 샘플1에서 여러 단백질을 추적하기 위해 광최적화된 형광 태그로 조작할 수 있지만, 단백질의 현미경 시각화는 기존의 DNA 형광 제자리 혼성화(FISH)와 호환되지 않는 경우가 많습니다.2 . 형광 기반 접근법을 사용하여 DNA, RNA 및 단백질을 동시에 시각화하는 기술적 한계로 인해 바이러스 복제에 대한 심층적인 이해가 방해를 받았습니다. 감염 과정에서 바이러스 핵산과 단백질을 모두 추적하면 바이러스 학자가 바이러스 복제 및 조립 3,4,5,6의 기초가되는 기본 프로세스를 시각화 할 수 있습니다.

당사는 핵산 검출의 민감도를 향상시키기 위해 분지형 DNA(bDNA) in situ 기술을 활용하는 D NA, RNA및 P로테인(MICDDRP)3의 궁극적인 형광 c ell 기반 이미징접근법을 개발했습니다.7,8,9 . 또한이 방법은 특이성을 높이기 위해 쌍을 이루는 프로브를 사용합니다. bDNA 서열 특이적 프로브는 분지 전치 증폭기 및 증폭기 DNA를 사용하여 강렬하고 국부적인 신호를 생성하여 DNA9의 반복 영역을 표적화하는 데 의존했던 이전의 혼성화 방법을 개선합니다. 임상 맥락에서 감염된 세포는 종종 풍부한 바이러스 유전 물질을 포함하지 않아 진단 환경에서 형광 핵산 검출을 위한 민감한 방법을 위한 상품을 제공합니다. RNAscope7 및 ViewRNA10과 같은 접근 방식을 통한 bDNA 기술의 상용화는 이러한 틈새 시장을 채웠습니다. bDNA 형광 이미징의 감도는 세포 생물학에서도 중요한 유용성을 가지며, 세포 배양 모델에서 부족한 핵산 종을 검출할 수 있습니다. 감도의 엄청난 향상으로 bDNA 기반 이미징 방법은 바이러스 연구에 적합합니다. 그러나 잠재적인 단점은 이러한 방법이 RNA 또는 RNA 및 단백질을 시각화하는 데 초점을 맞춘다는 것입니다. 모든 복제 세포와 많은 바이러스는 복제 주기 동안 DNA 게놈을 가지고 있거나 DNA를 형성하므로 단백질뿐만 아니라 RNA와 DNA를 모두 이미징할 수 있는 방법이 매우 바람직합니다.

MICDDRP 프로토콜에서 우리는 RNAscope 방법을 사용하여 바이러스 핵산 검출을 위해 bDNA FISH를 수행하며 수정7을 수행합니다. 이 프로토콜의 주요 수정 사항 중 하나는 화학적 고정 후 프로테아제 처리의 최적화입니다. 프로테아제 처리는 핵산에 결합된 단백질의 제거를 용이하게 하여 프로브 혼성화 효율을 개선합니다. 프로테아제 치료 후 분지형 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 인큐베이션이 이어집니다. bDNA 프로브(들)를 적용한 후, 샘플을 세척한 후 신호 전치 증폭기 및 증폭기 DNA와 함께 배양합니다. 여러 유전자 표적의 표지인 다중화 현장 혼성화(ISH)에는 스펙트럼 분화를 위해 서로 다른 색상 채널을 가진 표적 프로브가 필요합니다7. DNA 증폭기를 사용한 배양 후 면역 형광법 (IF)이 뒤 따른다.

bDNA ISH는 비특이적 혼성화 이벤트7,11로 인한 배경 잡음의 감소와 함께 표적 특이적 신호의 증폭에 의해 신호 대 잡음의 개선을 제공합니다. 표적 프로브는 비특이적 혼성화 이벤트의 확률을 예측하고 프로브-표적 하이브리드 7,11의 용융 온도(Tm)를 계산하는 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 설계되었습니다. 표적 프로브는 표적 DNA/RNA 서열, 스페이서 서열 및 14-염기 꼬리 서열에 상보적인 18-25-염기 영역을 포함합니다. 각각 뚜렷한 꼬리 서열을 가진 한 쌍의 표적 프로브는 표적 영역(~50개 염기에 걸쳐)에 혼성화됩니다. 두 개의 테일 시퀀스는 전-증폭기 프로브에 대한 혼성화 부위를 형성하며, 여기에는 증폭기 프로브에 대한 20개의 결합 부위가 포함되고, 이 결합 부위는 라벨 프로브에 대한 20개의 결합 부위를 추가로 포함합니다. 예를 들어, 핵산 분자의 1킬로베이스(kb) 영역은 20개의 프로브 쌍에 의해 표적화되어 전치 증폭기, 증폭기 및 라벨 프로브와의 순차적 혼성화를 위한 분자 스캐폴드를 생성합니다. 따라서 이는 핵산 분자당 8000개의 형광 표지의 이론적 수율로 이어질 수 있으며, 단일 분자의 검출을 가능하게 하고 기존 FISH 접근법7에 비해 크게 개선될 수 있습니다(bDNA 신호 증폭의 도식도는 그림 1A 참조). 멀티플렉스 ISH에 대한 프로브를 설정하려면 각 대상 프로브가 서로 다른 색상 채널(C1, C2 또는 C3)에 있어야 합니다. 서로 다른 색상 채널을 가진 이러한 표적 프로브는 뚜렷한 14-염기 꼬리 시퀀스를 가지고 있습니다. 이러한 테일 시퀀스는 서로 다른 형광 프로브와 별개의 신호 증폭기를 결합하여 여러 대상에서 스펙트럼을 쉽게 차별화할 수 있습니다. 제시된 프로토콜에서, 단계 9의 표 4는 형광 표지 표적 프로브에 대한 추가 정보를 제공한다. 또한 그림 2와 그림 3은 HIV-1 및 HTLV-1 감염 후 여러 바이러스 핵산 표적의 특정 형광 표지를 달성하기 위해 적절한 Amplifier 4-FL(A, B 또는 C)(형광 프로브 및 최종 혼성화 단계)을 선택한 방법의 예를 제공합니다.

우리는 RNA, DNA 및 단백질의 동시 형광 시각화의 여러 응용 프로그램을 시연하여 높은 시공간 분해능 3,4,5로 바이러스 복제의 중요한 단계를 관찰했습니다. 예를 들어, 바이러스 RNA, 세포질 및 핵 DNA, 단백질의 동시 단일 세포 시각화를 통해 핵 진입 및 프로 바이러스 DNA3의 통합 전에 세포질에 코어를 포함하는 RNA를 추적하는 것을 포함하여 HIV-1 감염 중 주요 이벤트를 시각화 할 수있었습니다. 또한 MICDDRP를 적용하여 바이러스 감염및 복제 4,5에 대한 숙주 인자 및 약물 치료의 효과를 특성화했습니다. Ukah et al.에서는 HIV 전사 및 잠복기 역전을 시각화하기 위해 다양한 잠복기 역전제로 처리된 잠복기 세포 모델에서 HIV-1 전사의 재활성화를 추적했습니다4. 또한 MICDDRP를 사용하면 소분자 치료 또는 숙주 인자 제한에 기인하는 항 바이러스 억제와 관련된 표현형 변화를 시각화 할 수 있습니다. 우리 접근 방식의 견고성과 광범위한 적용 가능성에 대한 개념 증명으로, 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1뿐만 아니라 인간 T- 림프 트로픽 바이러스 (HTLV) -1, B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 지카 바이러스 (ZIKV) 및 인플루엔자 A 바이러스 (IAV). HIV-1 수명 주기는 바이러스 DNA와 RNA 종으로 구성되어 있기 때문에 HIV-1 복제 역학에 따라 MICDDRP 최적화의 대부분을 수행했습니다. 그러나 또한 ZIKV, IAV, HBV 및 HCV와 같은 바이러스에서 센스(+) 및 안티센스(-) 가닥 중 하나 또는 둘 다의 서로 다른 바이러스 RNA 전사체의 합성을 추적하여 바이러스 전사및 복제 3,4,5,6을 모니터링할 수 있음을 입증했습니다. 이 연구는 여러 바이러스 과정에 대한 기계론적 이해를 개선하고 이 형광 이미징 기술을 광범위한 세포 모델에 구현하기 위한 지침 역할을 하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 커버슬립 또는 챔버 슬라이드의 시드 세포(현탁액 대 부착 세포)(제시된 프로토콜은 커버슬립을 사용함).

  1. 현탁 세포의 파종
    1. 먼저 커버 슬립을 에탄올 (EtOH)에서 5 분 동안 배양하여 폴리 -D- 라이신 (PDL) 코팅 커버 슬립 (커버 슬립에 현탁 세포의 부착을 용이하게)을 준비합니다 (커버 슬립을 멸균하고 잔류 물을 제거합니다). 그런 다음 실온(RT)에서 30분(분) 동안 PDL(20μg/mL)에서 커버슬립을 배양하기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)에서 2x 세척합니다.
    2. PDL을 제거하고 PBS에서 2 회 세척하십시오. 펠렛 세포(이전에 원하는 이미징 조건에 따라 감염/처리됨)를 50μL의 PBS에 106개의 세포를 재현탁합니다. 유리(PDL 코팅)에 50μL의 세포를 스팟하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 부착 세포의 파종
    1. 6웰 접시에 놓인 멸균 커버슬립에서 세포를 배양하고 바이러스 입자로 세포를 감염시키거나 관심 화합물로 치료합니다. 이미징 실험을 위한 샘플 준비 전에 세포가 50-70% 컨플루언시에 도달하도록 합니다.

2. 세포 고정: 형광 이미징 연구를 위한 세포 형태 보존

알림: 세포 고정 전에 최소 4분 동안 RT에서 30% PFA 및 PBS를 유지하십시오.

  1. 세포 배지를 흡인하고 PBS에서 커버 슬립으로 세포를 3x 세척하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 30 분 동안 세포를 고정합니다. PFA를 흡인하고 PBS 2x에서 세포를 세척합니다.
    참고: 실험자가 다른 날짜에 실험을 재개하려는 경우 이제 세포를 탈수하고 저장할 수 있습니다. 고정 세포는 저장 전에 EtOH에서 탈수될 수 있다.
    1. 세포 고정 후 세척 후 PBS를 제거하고 500μL의 50% EtOH(물에서 v/v)로 교체합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
    2. 50% EtOH를 제거하고 500μL의 70% EtOH로 교체합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
    3. 70% EtOH를 제거하고 500μL의 100% EtOH로 교체합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
    4. 100 % EtOH를 제거하고 신선한 100 % EtOH로 교체하십시오.
      참고: 탈수된 세포는 -20°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다. EtOH의 증발을 방지하기 위해 보관 전에 테이프 또는 파라필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
    5. 세포를 재수화하여 세포/바이러스의 다중 형광 라벨링으로 이동합니다.
    6. 100% EtOH를 제거하고 500μL의 70% EtOH로 교체합니다. RT에서 2 분 동안 배양하십시오.
      알림: 언제든지 세포가 마르지 않도록하십시오. 항상 모든 세포를 잠수하기에 충분한 용액을 사용하십시오.
    7. 70% EtOH를 제거하고 500 μL의 50% EtOH로 대체합니다. RT에서 2 분 동안 배양하십시오.
    8. 50 % EtOH를 제거하고 1x PBS로 교체하십시오.
      참고: 프로테아제 치료(4단계) 및 표적 프로브 적용(5단계) 전에 프로테아제 희석액, 혼성화 프로브 및 세척 완충액을 준비합니다. 시약 준비에 대한 구체적인 지침은 각 단계의 시작 부분에 나와 있습니다.
시약다른 메모
프로테아제 용액1X PBS에서 준비
표적 올리고뉴클레토디 프로브혼성화 완충액에 희석
세척 버퍼표적 혼성화 단계에 따른 세척
하이브리드화 버퍼표 3에 제시된 레시피

표 1: MICDDRP 프로토콜의 주요 시약.

3. 세포 투과화: 큰 분자(항체, 핵산 혼성화 프로브)의 진입을 위해 세포 및 세포 소기관으로의 접근성 증가

  1. 세포 고정 또는 재수화 후 1x PBS를 제거하고 1x PBS에서 0.1%(v/v) 트윈-20의 500μL로 교체합니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오. 하나씩 교체하십시오. 500μL의 1x PBS로 한 번 세척하고 새로운 1x PBS를 추가합니다.

4. 유리 슬라이드에 커버슬립 고정 화 및 프로테아제 처리를 통해 고정된 바이러스/세포 핵산에서 핵산 결합 단백질을 제거하여 하이브리드화 효율을 향상시킵니다.

참고: 세포 투과 중에 희석된 프로테아제 III( 재료 표의 시약에 대한 세부 사항 참조) 용액을 준비하십시오. 투과화 전에 프로테아제가 RT에 도달하도록 10분 동안 두십시오.

  1. 멸균 된 유리 슬라이드에 작은 매니큐어 방울을 놓습니다. 뒷면을 건조시키고(세포층이 없는 면) 커버슬립의 가장자리를 매니큐어 드롭에 놓고 부착된 셀이 위쪽을 향하도록 합니다. 건조를 방지하기 위해 고정된 커버슬립에 PBS 몇 방울을 추가합니다.
    1. 소수성 배리어 펜(시약을 세포에 국한시키는 발수성 펜)을 사용하여 슬라이드에 부착된 커버슬립 둘레에 원(커버슬립에서 약 3mm 떨어진 곳)을 그립니다.
  2. 프로테아제 III를 1x PBS (100 μL / 커버 슬립)로 희석합니다.
    참고: 프로테아제 농도는 경험적 최적화를 통해 세포 유형, 프로브 또는 표적 핵산의 차이에 따라 조정해야 할 수 있습니다( 토론 참조). 다양한 바이러스 시스템에서 가장 효율적인 RNA/DNA 표지를 위해 아래 표 2 에 제시된 다음 희석액으로 (1에서 2)-(1에서 15) 범위의 희석(프로테아제에서 1x PBS까지)으로 성공했습니다.
프로브 타겟1X PBS (프로테아제 III 내지 1X PBS)에서 프로테아제 희석
HIV-1 DNA / RNA1에서 5
HTLV-1 DNA/RNA1에서 5
HBV pgRNA 및 총 HBV RNA1에서 15
IAV RNA1에서 15
지크브 RNA1에서 2

표 2: 바이러스 핵산 혼성화를 위한 PBS 중의 프로테아제 III 희석물.

  1. 고정 후 커버슬립에 1x PBS를 디캔트하고 희석된 프로테아제 III를 적용합니다.
  2. 40°C의 가습 오븐에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 프로테아제 용액을 디캔트하고 슬라이드를 1x PBS에 담그십시오. RT에서 2분 동안 흔들리는 접시로 교반합니다. 새로운 1x PBS로 세척을 반복합니다.
    1. DNA 검출 만을 위해, 뉴클레아제가 없는 물로 샘플을 각각 2분 동안 3회 세척한 다음, PBS에 희석된 5mg/mL RNase A를 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    2. RNase A 용액을 디캔트하고, 초순수로 2분 동안 3회 세척한다. 대상 프로브의 ISH를 계속 진행합니다.
      참고: 혼성화 완충액은 제시된 결과에 대한 vRNA 염색 효율에 영향을 미치지 않고 vDNA 검출을 개선합니다(대표 결과). DNA 채널 1(C1) 프로브를 혼성화 프로브로 1:1로 희석합니다. RNA C2 및 C3 프로브를 혼성화 완충액에 희석합니다. 이미징 연구에 사용된 C2 및 C3 프로브는 50X 용액(1:50, 표적 프로브에서 하이브리드화 버퍼 까지 )에 있습니다.
  4. 아래의 단계별 절차에 따라 뉴클레아제가 없는 물에서 혼성화 완충액을 준비합니다.
    1. 15mL 튜브에 뉴클레아제 자유수 700μL, 50%(중량/부피(w/v)) 덱스트란 설페이트 300μL, 5M NaCl 300μL, 200mM 시트르산나트륨(pH 6.2) 125μL, 탄산에틸렌 375mg(분말)을 추가합니다.
    2. 와류를 사용하여 에틸렌 카보네이트를 용해시켜 잘 혼합합니다 (모든 분말이 용해되고 투명한 용액인지 확인하십시오).
    3. 25 μL의 10%(부피/부피(v/v)) 트윈-20과 충분한 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 2.5mL(2x 용액)를 완성합니다.
      참고: 제시된 혼성화 완충액의 제조법은 아래 표 3 에서 찾을 수 있습니다. 솔루션은 일주일 동안 안정적입니다. Tween-20 세제가 충분히 혼합되었는지 확인하고 용액의 거품을 방지하도록 주의하십시오.
시약주식 집중추가 참고 사항
뉴클레아제가 없는 물해당 없음
덱스 트란 설페이트50% (승/광)매우 점성
소금5미터
구연산 나트륨 (pH 6.2)200 밀리미터4 °C에서 보관
에틸렌 카보네이트해당 없음가루
트윈-2010% (V/V)

표 3: 시약의 혼성화 완충액 목록.

5. DNA/RNA 표적 하이브리드화 프로브를 사용한 인큐베이션: 표적 올리고뉴클레오티드 프로브는 관심 영역에 결합하여 전치 증폭기, 증폭기 및 형광 프로브가 결합할 수 있는 분자 스캐폴드를 생성합니다.

참고: DNA/RNA 프로브를 40°C에서 10분 동안(세포 투과화 중) 따뜻하게 하고 RNase 처리가 포함되지 않은 경우 최소 10분 동안 RT로 냉각합니다. 표적 프로브 혼성화 전에 RNase 처리 또는 추가 샘플 처리가 필요한 경우 그에 따라 프로브를 따뜻하게 합니다. 예열 후 C2 및 C3 프로브를 스핀다운하고 하이브리드화 버퍼에서 희석합니다. 희석 후 C2 및 C3 프로브를 잠시 예열 할 수 있습니다. 40°C에서 10-20분 동안 50x 세척 완충액(자세한 내용은 재료 표 참조)을 데우고 분자 생물학 등급 물에서 1x로 희석합니다.

  1. 하이브리드화 프로브(들)를 첨가하기 전에 67°C에서 10분 동안 200μL의 하이브리드화 완충액을 인큐베이션합니다. 프로브를 혼성화 완충액으로 희석한다( 표 2에 나열된 레시피). 50 μL/커버슬립을 추가합니다.
  2. 40°C의 가습 오븐에서 2시간(h) 동안 배양합니다. 디캔트 프로브와 1x 세척 버퍼에 슬라이드를 담그십시오. RT에서 2분 동안 접시를 흔들어 교반합니다. 새로운 1x 세척 버퍼로 세척을 반복합니다.

6. 증폭기(Amp) 1-FL 혼성화: 표적 DNA/RNA 프로브의 꼬리 서열에 상보적인 전치 증폭기 추가(단계 5)

알림: 앰프는 사용하기 전에 RT에 있어야합니다. 각 개별 앰프를 사용하기 30분 전에 냉장고에서 꺼내 RT의 벤치에 두십시오.

  1. 1x 세척 버퍼에서 슬라이드를 제거하고 탭/흡수하여 과도한 액체를 제거합니다.
  2. 커버슬립에 Amp 1-FL 1방울을 추가합니다. 40°C의 가습 오븐에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 디캔트 앰프 1-FL을 넣고 1x 세척 버퍼에 담그십시오. RT에서 2분 동안 접시를 흔들어 교반합니다. 새로운 1x 세척 버퍼로 세척을 반복합니다.

7. Amp 2-FL 하이브리드화: 동족 인식 시퀀스가 있는 신호 증폭기를 사전 증폭기로 인큐베이션(Amp 1-FL)

  1. 1x 세척 버퍼에서 슬라이드를 제거하고 탭/흡수하여 과도한 액체를 제거합니다.
  2. 커버슬립에 Amp 1-FL 2방울을 추가합니다. 40°C의 가습 오븐에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 디캔트 앰프 2-FL을 넣고 1x 세척 버퍼에 담그십시오. RT에서 2분 동안 접시를 흔들어 교반합니다. 새로운 1x 세척 버퍼로 세척을 반복합니다.

8. 앰프 3-FL 하이브리드화: 두 번째 신호 증폭기를 사용한 인큐베이션

  1. 1x 세척 버퍼에서 슬라이드를 제거하고 탭/흡수하여 과도한 액체를 제거합니다.
  2. 커버 슬립에 Amp 1-FL 3방울을 추가합니다. 40°C의 가습 오븐에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 디캔트 앰프 3-FL을 넣고 1x 세척 버퍼에 담그십시오. RT에서 2분 동안 접시를 흔들어 교반합니다. 새로운 1x 세척 버퍼로 세척을 반복합니다.

9. Amp 4-FL 혼성화: 형광 표지 및 최종 혼성화 단계

알림: 먼저 표 4를 참조하여 대상 프로브의 채널을 기반으로 적합한 Amp 4(A,B 또는 C)-FL을 선택합니다. 관심 있는 DNA/RNA를 라벨링하는 데 필요한 Amp 4-FL을 평가합니다. 아래 표에 예가 나와 있습니다.

ABC
DNA 채널 1 (C1)488550550
DNA/RNA 채널 2 (C2)550488647
RNA 채널 3 (C3)647647488

표 4: 멀티플렉싱된 ISH를 위한 Amp 4(A, B 또는 C)-FL 형광 프로브 선택.

알림: 멀티플렉스 FISH(다중 대상)의 경우 올바른 Amp 4(A, B 또는 C)-FL을 선택하는 것이 관심 대상에 레이블을 지정하는 데 중요합니다. 타겟 프로브(5단계)에는 선택한 Amp 4-FL에 따라 각각의 형광 라벨(Alexa 488, Atto 550 또는 Alexa 647)을 지정하는 다양한 색상 채널(C1, C2 또는 C3)이 있습니다. 멀티플렉스 이미징을 위한 형광단 조합을 선택하는 예는 그림 2 및 그림 3의 범례에 나와 있습니다. 추가 예로, Amp 4B-FL을 선택하면 Atto 550으로 DNA C1 프로브를 선택적으로 표지하고 Alexa 647로 RNA C3 프로브를 선택적으로 표지합니다.

  1. 1x 세척 버퍼에서 슬라이드를 제거하고 탭/흡수하여 과도한 액체를 제거합니다.
  2. 커버슬립에 Amp 1-FL 4방울을 추가합니다. 40°C의 가습 오븐에서 15분 동안 배양합니다.
    알림: 9.2 단계에 따라 샘플을 덮고 빛으로부터 보호하십시오.
  3. 디캔트 앰프 4-FL을 넣고 1x 세척 버퍼에 담그십시오. RT에서 2분 동안 접시를 흔들어 교반합니다. 새로운 1x 세척 버퍼로 세척을 반복합니다. 1x PBS로 세척하고(2분) PBS에 보관합니다.

10. 단백질 면역염색: 관심 단백질에 라벨을 부착하기 위해

  1. PBS를 디캔트하고 200μL의 블로킹 버퍼(1% w/v BSA, 0.1% v/v 트윈-20(PBST)가 있는 PBS에서 10% v/v FBS)를 커버슬립에 추가합니다. RT에서 1 시간 배양하십시오.
  2. 블로킹 완충액을 디캔트하고 PBST + 1% w/v BSA에 희석된 200μL의 1차 항체를 적용합니다. RT에서 1 시간 배양하십시오.
  3. 흔들면서 RT에서 10분 동안 PBST로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
  4. PBST + 1% w/v BSA의 RT에서 1시간 동안 선택한 2차 항체를 적용합니다.
  5. 흔들면서 RT에서 10분 동안 PBST로 슬라이드를 세척합니다.

11. 핵 염색: 면역염색 후 반대 염색 핵

  1. PBST를 디캔트하고 RT에서 1분 동안 선택한 DAPI 또는 핵 염색을 적용합니다.
  2. 흔들면서 RT에서 10분 동안 PBS로 슬라이드를 두 번 세척합니다.

12. 장착

  1. 새 멸균 유리 슬라이드에 페이드 방지 용액(예: Proextend Gold) 1방울을 놓습니다(먼저 EtOH로 슬라이드를 청소하고 유리에 잔여물이 없도록 건조시키십시오). 같은 팁으로 페이드 방지 솔루션 드롭을 펴서 커버슬립 크기의 영역을 덮습니다.
    참고: 페이드 방지 용액은 점성이 매우 높으며 피펫팅하기 어려울 수 있습니다. 피펫팅 전에 팁을 200μL 절단하면 이러한 문제를 완화할 수 있습니다.
  2. 슬라이드에서 셀 샘플이 있는 커버슬립을 제거하고 PBS에 담그면 집게와 PBS를 사용하여 뒷면에 남아 있는 매니큐어를 제거합니다. 집게와 커버슬립 뒷면을 킴와이프를 사용하여 건조시킵니다.
  3. 페이드 방지 용액 방울에 커버슬립을 부드럽게 삽입하고 커버슬립의 샘플 면(셀층이 있는 면)을 드롭에 놓습니다.
  4. 샘플을 밤새 건조시키십시오.

13. 이미징

  1. 에피형광 현미경을 사용한 이미지.

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결과

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MICDDRP의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. DNA와 RNA의 표지 후 면역 염색이 이어집니다. 분기 증폭기를 사용하면 신호가 증가하여 단일 핵산 분자를 검출 할 수 있습니다.

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그림 1: MICDDRP 및 단계별 워크플로우의 개략도. (A) bDNA 신호는 바이러스 DNA (1) 및 RNA 종 (2)의 검출을 향상시키기 위해 분지 프리 앰프 및 증폭기 DNA를 통해 증폭됩니다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 관심 대상(들)에 쌍(회로도의 ZZ)으로 혼성화되어 전치 증폭기(Amp 1-FL, 프로토콜의 단계 6), 증폭기(...

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토론

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RNA, DNA 및 단백질의 동시 시각화에는 종종 광범위한 최적화가 필요합니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 방법은 5-에티닐-2-데옥시우리딘(EdU) 표지와 DNA FISH입니다. EdU 라벨링은 EdU가 초기 DNA에 통합되고 클릭 화학을 통해 아지드 함유 형광 염료로 라벨링되기 때문에 바이러스 DNA와 단백질을 동시에 시각화하는 데 적용되었습니다. 따라서, EdU 표지는 복제12를 위한 DNA 주형을 사용하여 DNA 바이러스 또는 바이러스의 천연 바이러스 복제 동역학을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 그러나 EdU 라벨링의 단점은 분열하는 세포에서 복제 게놈이 EdU를 통합하여 높은 배경과 혼란스러운 이미지 분석을 생성한다는 것입니다. DNA FISH는 세포주기에 관계없이 핵산 프로브를 각 표적에 직접 혼성화함으로써 이러한 문제를 피할 수 있습니다. 그러나, 종래의 FISH는 종종 효율적인 프로브 혼성화를 달성하기 위해 고온에 의존하여 면역염색 또는 심지어 동시 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 국립 보건원 (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 및 U54 AI150472)에서 전체 또는 부분적으로 지원했습니다. 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 세포를 제공한 Raymond F. Schinazi 박사와 Sadie Amichai 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% PFA
50% 덱스트란 설페이트Amreso198DNA 혼성화 완충액
50X 세척 완충액ACD 바이오320058
6웰 플레이트
증폭기 1-FLACD 바이오
증폭기 2-FLACD 바이오
증폭기 3-FLACD
증폭기 4-FLACD BioConsult Amp-4 표
프로토콜 Anti-HCV NS5a 항체Abcamab13833마우스 단클론; HCV 유전자형 1a, 1b, 3 및 4
항 HIV-1 p24 단클론 항체NIH AIDS 시약 프로그램3537
Anti-Mov10 항체Abcamab80613토끼 다클론 항체
항-PB1 항체GeneTexGTX125923독감 단백질에 대한 항체
소 혈청 알부민면역염색을 위한 차단 시약
보충제세포 모델에 적합한 배지
커버슬립
DAPIACD Bio핵 염색(ACD Bio의 RNAscope 키트)
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(1X PBS)Gibco14190250칼슘 및 마그네슘
없음 에틸렌 카보네이Sigma E26258
소 태아 혈청(FBS)청 2차 항체가 발생한 것에 따라 특정 FBS 사용(예: 염소 FBS)
Fisherbrand colorfrost plus 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-17/18/19사전 세척
HCV-GT2a-sense-C2 프로브ACD Bio441371HCV(+) 감지 RNA 프로브
HIV-gagpol-C1ACD Bio317701HIV-1 cDNA 프로브
HIV-nongagpol-C3ACD Bio317711-CHIV-1 RNA 프로브
HybEZ 혼성화 오븐ACD Bio321710/321720
ImmEdge 소수성 장벽 펜Vector LaboratoriesH-4000
매니큐어프로테아제 처리 전에 슬라이드하는 커버슬립을 면역화하기 위해
뉴클레아제 무료 물AmbionAM9937
Poly-d-lysine (PDL)20 µ에 있는 커버 슬립 코트; 30분 동안 PDL의 g/mL
프로브 희석제ACD Bio300041RNA C2 또는 C3 프로브 희석용
금 퇴색 방지InvitrogenP36930
Protease IIIACD Bio322337
RNAscope® 연장;   프로브- V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221
RNase AQiagen
2차 항체
슬라이드
염화DNA 혼성화 완충액
구연산나트륨, pH 6.2DNA 혼성화 완충액
Tween-20DNA 혼성화 완충액 및 PBS-T,
V-HBV-GTDACD Bio, 441351Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2ACD Bio465531-C2HBV pgRNA 프로브
V-HCV-GT2a 프로브ACD Bio441361HCV(-) 감지 RNA 프로브
V-HTLV-HBZ-sense-C3ACD Bio495071-C3HTLV-1(-) 감지 RNA 프로브, HBZ 타겟팅
V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2HTLV-1 DNA 프로브
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD Bio495061HTLV-1 (+) 감지 RNA 프로브
V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221IAV RNA 프로브
V-ZIKA-pp-O2ACD Bio464531Zika(+) 감지 RNA 프로브
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2ACD Bio478731-C2Zika(-) 감지 RNA 탐침
바이오가 함유된 세포 배지 트 혈나트륨 , , , , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).
  4. Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
  5. Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
  6. Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
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  9. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  10. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
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  12. Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
  13. Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
  14. Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).
  15. Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).

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