여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.
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방법 논문
바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
바이러스의 동적 복제 및 조립 프로세스를 캡처하는 것은 바이러스 핵산 및 단백질의 민감하고 동시 표지를 가능하게 하는 강력한 현장 혼성화(ISH) 기술의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 기존의 DNA 형광 제자리 혼성화(FISH) 방법은 종종 면역염색과 호환되지 않습니다. 따라서 우리는 DNA, RNA 및 단백질의 동시 단일 세포 시각화를 가능하게하는 이미징 접근법 인 MICDDRP (DNA, R NA 및 protein의 궁극적 인 형광 c ell 기반dtection)를 개발했습니다. 기존의 DNA FISH와 비교하여 MICDRP는 분지 DNA(bDNA) ISH 기술을 활용하여 올리고뉴클레오티드 프로브 감도와 검출을 크게 향상시킵니다. MICDDRP의 작은 변형은 다른 가닥의 핵산 (RNA 또는 DNA)과 함께 바이러스 단백질의 이미징을 가능하게합니다. 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1, 인간 T- 림프 트로픽 바이러스 (HTLV) -1, B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 지카 바이러스 (ZKV) 및 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)를 포함한 여러 바이러스 병원체의 수명주기를 연구하기 위해 이러한 프로토콜을 적용했습니다. 우리는 다양한 범위의 바이러스에 걸쳐 바이러스 핵산과 단백질을 효율적으로 라벨링할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 연구는 여러 바이러스 시스템에 대한 향상된 기계론적 이해를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 광범위한 세포 시스템에 걸쳐 DNA, RNA 및 단백질의 다중 형광 이미징을 적용하기 위한 템플릿 역할을 할 수 있습니다.
서론
기존의 면역염색 접근법을 통해 수천 개의 상용 항체를 사용하여 단백질을 특이적으로 표지할 수 있고, 융합 단백질은 샘플1에서 여러 단백질을 추적하기 위해 광최적화된 형광 태그로 조작할 수 있지만, 단백질의 현미경 시각화는 기존의 DNA 형광 제자리 혼성화(FISH)와 호환되지 않는 경우가 많습니다.2 . 형광 기반 접근법을 사용하여 DNA, RNA 및 단백질을 동시에 시각화하는 기술적 한계로 인해 바이러스 복제에 대한 심층적인 이해가 방해를 받았습니다. 감염 과정에서 바이러스 핵산과 단백질을 모두 추적하면 바이러스 학자가 바이러스 복제 및 조립 3,4,5,6의 기초가되는 기본 프로세스를 시각화 할 수 있습니다.
당사는 핵산 검출의 민감도를 향상시키기 위해 분지형 DNA(bDNA) in situ 기술을 활용하는 D NA, RNA및
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프로토콜
1. 커버슬립 또는 챔버 슬라이드의 시드 세포(현탁액 대 부착 세포)(제시된 프로토콜은 커버슬립을 사용함).
- 현탁 세포의 파종
- 먼저 커버 슬립을 에탄올 (EtOH)에서 5 분 동안 배양하여 폴리 -D- 라이신 (PDL) 코팅 커버 슬립 (커버 슬립에 현탁 세포의 부착을 용이하게)을 준비합니다 (커버 슬립을 멸균하고 잔류 물을 제거합니다). 그런 다음 실온(RT)에서 30분(분) 동안 PDL(20μg/mL)에서 커버슬립을 배양하기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)에서 2x 세척합니다.
- PDL을 제거하고 PBS에서 2 회 세척하십시오. 펠렛 세포(이전에 원하는 이미징 조건에 따라 감염/처리됨)를 50μL의 PBS에 106개의 세포를 재현탁합니다. 유리(PDL 코팅)에 50μL의 세포를 스팟하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 부착 세포의 파종
- 6웰 접시에 놓인 멸균 커버슬립에서 세포를 배양하고 바이러스 입자로 세포를 감염시키거나 관심 화합물로 치료합니다. 이미징 실험을 위한 샘플 준비 전에 세포가 50-70% 컨플루언시에 도달하도록 합니다.
2. 세포 고정: 형광 이미징 연구를 위....
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결과
MICDDRP의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. DNA와 RNA의 표지 후 면역 염색이 이어집니다. 분기 증폭기를 사용하면 신호가 증가하여 단일 핵산 분자를 검출 할 수 있습니다.
그림 1: MICDDRP 및 단계별 워크플로우의 개략도. (A) bDNA 신호는 바이러스 DNA (1) 및 RNA 종 (2)의 검출을 향상시키기 위해 분지 프리 앰프 및 증폭기 DNA를 통해 증폭됩니다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 관심 대상(들)에 쌍(회로도의 ZZ)으로 혼성화되어 전치 증폭기(Amp 1-FL, 프로토콜의 단계 6), 증폭기(.......
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토론
RNA, DNA 및 단백질의 동시 시각화에는 종종 광범위한 최적화가 필요합니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 방법은 5-에티닐-2-데옥시우리딘(EdU) 표지와 DNA FISH입니다. EdU 라벨링은 EdU가 초기 DNA에 통합되고 클릭 화학을 통해 아지드 함유 형광 염료로 라벨링되기 때문에 바이러스 DNA와 단백질을 동시에 시각화하는 데 적용되었습니다. 따라서, EdU 표지는 복제12를 위한 DNA 주형을 사용하여 DNA 바이러스 또는 바이러스의 천연 바이러스 복제 동역학을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 그러나 EdU 라벨링의 단점은 분열하는 세포에서 복제 게놈이 EdU를 통합하여 높은 배경과 혼란스러운 이미지 분석을 생성한다는 것입니다. DNA FISH는 세포주기에 관계없이 핵산 프로브를 각 표적에 직접 혼성화함으로써 이러한 문제를 피할 수 있습니다. 그러나, 종래의 FISH는 종종 효율적인 프로브 혼성화를 달성하기 위해 고온에 의존하여 면역염색 또는 심지어 동시 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 및 U54 AI150472)에서 전체 또는 부분적으로 지원했습니다. 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 세포를 제공한 Raymond F. Schinazi 박사와 Sadie Amichai 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | |||
| 50% 덱스트란 설페이트 | Amreso | 198 | DNA 혼성화 완충액 |
| 50X 세척 완충액 | ACD 바이오 | 320058 | |
| 6웰 플레이트 | |||
| 증폭기 1-FL | ACD 바이오 | ||
| 증폭기 2-FL | ACD 바이오 | ||
| 증폭기 3-FL | ACD | ||
| 증폭기 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 표 | |
| 프로토콜 Anti-HCV NS5a 항체 | Abcam | ab13833 | 마우스 단클론; HCV 유전자형 1a, 1b, 3 및 4 |
| 항 HIV-1 p24 단클론 항체 | NIH AIDS 시약 프로그램 | 3537 | |
| Anti-Mov10 항체 | Abcam | ab80613 | 토끼 다클론 항체 |
| 항-PB1 항체 | GeneTex | GTX125923 | 독감 단백질에 대한 항체 |
| 소 혈청 알부민 | 면역염색을 위한 차단 시약 | ||
| 보충제 | 세포 모델에 적합한 배지 | ||
| 커버슬립 | |||
| DAPI | ACD Bio | 핵 염색(ACD Bio의 RNAscope 키트) | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(1X PBS) | Gibco | 14190250 | 칼슘 및 마그네슘 |
| 없음 에틸렌 카보네이 | Sigma E26258 | ||
| 소 태아 혈청(FBS) | 청 2차 항체가 발생한 것에 따라 특정 FBS 사용(예: 염소 FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | 사전 세척 |
| HCV-GT2a-sense-C2 프로브 | ACD Bio | 441371 | HCV(+) 감지 RNA 프로브 |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA 프로브 |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA 프로브 |
| HybEZ 혼성화 오븐 | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge 소수성 장벽 펜 | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 매니큐어 | 프로테아제 처리 전에 슬라이드하는 커버슬립을 면역화하기 위해 | ||
| 뉴클레아제 무료 물 | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | 20 µ에 있는 커버 슬립 코트; 30분 동안 PDL의 g/mL | ||
| 프로브 희석제 | ACD Bio | 300041 | RNA C2 또는 C3 프로브 희석용 |
| 금 퇴색 방지 | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® 연장; 프로브- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| 2차 항체 | |||
| 슬라이드 | |||
| 염화 | DNA 혼성화 완충액 | ||
| 구연산나트륨, pH 6.2 | DNA 혼성화 완충액 | ||
| Tween-20 | DNA 혼성화 완충액 및 PBS-T, | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | , 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA 프로브 |
| V-HCV-GT2a 프로브 | ACD Bio | 441361 | HCV(-) 감지 RNA 프로브 |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1(-) 감지 RNA 프로브, HBZ 타겟팅 |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA 프로브 |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) 감지 RNA 프로브 |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA 프로브 |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) 감지 RNA 프로브 |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) 감지 RNA 탐침 |
참고문헌
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (....
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재인쇄 및 허가
