Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

Mateusz Adam Krzyscik; Aleksandra Sokolowska-Wedzina; Karolina Jendryczko; Marta Pozniak; Daria Nawrocka; Natalia Porebska; Malgorzata Zakrzewska; Jacek Otlewski; Anna Szlachcic; Lukasz Opalinski

doi:10.3791/61918

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방법 논문

Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

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DOI:

10.3791/61918

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2021년 1월 5일

Mateusz Adam Krzyscik¹^,² , Aleksandra Sokolowska-Wedzina¹ , Karolina Jendryczko¹ , Marta Pozniak¹ , Daria Nawrocka¹ , Natalia Porebska¹ , Malgorzata Zakrzewska¹ , Jacek Otlewski¹ , Anna Szlachcic¹ , Lukasz Opalinski¹

¹Department of Protein Engineering, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, ²Department of Protein Biotechnology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

이 논문에서

요약

여기에서는 maleimide-thiol 반응 및 sortase A 매개 ligation을 사용하여 세포독성 약물로 단백질의 부위 특이적 라벨링을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

암은 현재 전 세계적으로 두 번째로 흔한 사망 원인입니다. 암세포의 특징은 성장 인자 수용체(growth factor receptor)와 같은 특정 마커 단백질(specific marker protein)이 표면에 존재한다는 것입니다. 이 기능을 통해 특정 링커에 의해 고농도 세포독성 약물에 연결된 표적 단백질(항체 또는 수용체 리간드)로 구성된 단백질 바이오콘주게이트인 매우 선택적인 치료제의 개발을 가능하게 합니다. 표적 단백질의 매우 높은 친화력과 선택성으로 인해 bioconjugates는 암세포 표면의 marker 단백질을 인식하고 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 활용하여 세포 내부에 도달합니다. 세포 내 소포 수송 시스템은 궁극적으로 바이오접합체를 리소좀으로 전달하며, 여기서 단백질 분해는 바이오접합체의 단백질 코어에서 유리 세포독성 약물을 분리하여 약물 의존성 암세포 사멸을 유발합니다. 현재 암 치료용으로 승인된 여러 단백질 생체접합체가 있으며 그 중 다수가 개발 중이거나 임상 시험 중입니다.

생체접합체 생성의 주요 과제 중 하나는 세포독성 약물이 표적 단백질에 부위 특이적으로 부착되는 것입니다. 최근 몇 년 동안 세포독성 약물을 이용한 단백질 변형을 위한 화학적 및 효소적 전략 개발이 크게 진전을 이루었습니다. 여기에서는 말레이미드-티올 화학을 사용하는 화학적 방법과 sortase A-매개 접합에 의존하는 효소적 접근법을 사용하여 세포독성 탄두를 표적 단백질에 부위 특이적으로 통합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 섬유아세포 성장 인자 2의 공학적 변이체와 인간 면역글로불린 G의 결정화 가능한 부위를 예시적인 표적 단백질로 사용하며, 모노메틸 오리스타틴 E 및 메토트렉세이트를 세포독성 약물 모델로 사용합니다. 설명된 모든 전략은 다양한 암의 선택적 치료 가능성이 있는 정의된 분자 구조의 생물학적으로 활성화된 세포독성 접합체의 매우 효율적인 생성을 가능하게 합니다.

서론

수십 년에 걸친 과학적 노력은 암 발병과 진행을 관장하는 분자 메커니즘에 대한 지식의 엄청난 발전으로 이어졌습니다. 동시에 약물의 선택성 부족으로 인한 약물의 부작용, 종양의 큰 변동성 및 장기간의 치료 후 발생하는 약물 내성으로 인해 치료 가능성은 여전히 크게 제한되어 있습니다. 표적 항암 요법은 최근 몇 년 동안 다양한 종양 치료를 위한 새롭고 매우 유망한 접근 방식으로 주목받고 있습니다. 표적 치료제는 세포독성 페이로드를 암세포에 정확하게 전달하고 건강한 세포를 살리는 정교한 약물 전달 시스템에 의존합니다. 여기에는 주로 다양한 나노 입자, 리포좀 및 단백질 기반 약물 전달체가 포함됩니다.

암세포는 종종 표면에 높은 수준의 특정 마커 단백질을 노출시킵니다. 항체 약물 접합체(ADC)는 새로운 단백질 기반 항암 치료제로, 단일 클론 항체의 극도의 특이성과 약물의 높은 세포 독성 효능을 하나의 분자에 결합합니다. 일단 암 세포 표면에 결합되면, ADC는 수용체 매개 세포내이입(receptor-mediated endocytosis)을 이용하여 세포로 들어갑니다. 그 후, ADC는 엔도솜 구획을 통해 리소좀으로 운반되며, 여기서 프로테아제는 ADC를 분해하고 활성 세포독성 약물을 방출....