형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률의 주요^원인이며 심근병증은 심장 관련 사망의 세 번째 원인을 나타낸다^2. 심근병증은 심장 근육에 영향을 미치는 질병의 집단 그룹입니다. 유도 된 다능성 줄기 (iPS) 세포와 심근 세포 (PSC-CM)를 향한 iPS 세포의 지시 분화의 최근 개발은 심근병증의 체외 모델로 환자 게놈으로 심근세포를 연구하기위한 문을 열었습니다. 이들 세포는 심장 질환의 병리생리학을 이해하고, 분자 메커니즘을 해명하고, 다른 치료 후보^3을테스트하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 환자 유래 iPS 세포가 생성되었다(예를 들어, 비대성 심근병증 [HCM]^4,5,부정맥 우심심근병증 [ARVC]^6,확장된 심근병증 [DCM]^7,및 미토콘드리아 관련 심근병증,^{미토콘드리아}관련 심근병증^이있다. 심근병증의 특성 중 하나는 sarcomeres의 기능 장애 및 중단이기 때문에, 상반신 기능을 균일하게 측정하는 유효한 도구가 필요합니다.

Sarcomere 단축은 동물 모델과 인간에서 파생 된 성인 심근 세포의 sarcomere 기능과 수축을 평가하는 가장 널리 사용되는 기술입니다. 사컴레 단축을 수행하려면 위상 대비하에서 보이는 잘 발달된 사카레가 필요합니다. 그러나, 시험관 내 디스플레이에서 배양된 PSC-CM은 저개발 및 무질서한 사코머를 나타내므로, 따라서, 사르코름^{단축(10)을}제대로 측정하는 데 사용할 수 없다. PSC-CM의 수축성을 제대로 평가하는 이 어려움은 시험관 내심장 기능을 평가하는 플랫폼으로서의 사용을 방해합니다. PSC-CM 수축을 간접적으로 평가하기 위해, 원자력 현미경 검사법, 마이크로 포스트 어레이, 견인력 현미경 검사법 및 임피던스 측정은 이러한 세포가 주변 환경에 가해지는 모션의 효과를 측정하는 데 사용되어 왔다^11,12,13. 실제 세포 운동의 보다 정교하고 덜 침습적인 비디오 현미경 기록(예를 들어, 소니로부터 SI8000)은 수축도 를 대안적으로 평가하는 데 사용될 수 있지만, 이 방법은 사르코메어 모션 또는 강제 생성^{운동학(14)을}직접 측정하지 는 않는다.

PSC-CM에서 사코머 운동을 직접 측정하기 위해, 사코머 단백질에 형광 태깅과 같은 새로운 접근이 나타나고 있습니다. 예를 들어 Lifeact는 사마필모션(15,^16)을측정하기 위해 필라멘트 액틴(F-actin)에 라벨을 붙이는 데^{사용된다.} 유전자 변형 iPS 세포는 형광단백질^17,18,19에의해 사코메르 단백질(예를 들어, α 액틴 [ACTN2] 및 Myomesin-2 [MYOM2])를 태깅하기 위한 또 다른 옵션이다.

이 논문에서는 Myom2-TagRFP(마우스 배아 줄기 [ES] 세포) 및 ACTN2-mCherry(인간 iPS 세포)를 사용하여 sarcomere 단축을 측정하기 위한 타임랩스 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 패턴 문화가 사마머 정렬을 용이하게한다는 것을 보여줍니다. 또한, 당사는 환자 유래 iPS 세포에 널리 적용될 수 있는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 사르메레 라벨링의 대체 방법을 설명합니다.

1. 마우스 다능성 줄기 세포의 분화

1. 마우스 ES 셀의 유지 보수
   1. 유지 보수 매체: 50mL의 태아 소 세럼(FBS), L-Alanine-L-글루타민 5mL, 비필수 아미노산(NEAA), 5mL 100mM 나트륨 피루바테, 55mMM 2-메르카포에타놀 909 μl(450m MM) 최소 450m)를 혼합합니다. 백혈병 억제 인자(LIF), CHIR-99021 및 PD0325901을 각각 1000 U/mL, 1 μM 및 3 μM의 최종 농도로 보충합니다. 0.22 μm 필터를 통해 배지를 살균합니다.
   2. FBS 배지: 55mL의 FBS, L-알라닌-L-글루타민 5.5mL, 피루바테 나트륨 5.5mL, 그리고 5.5mL의 NEAA에서 500mL까지 덜벡코의 수정이글 매체(DMEM) 높은 포도당. 멸균하기 위해 0.22 μm 필터를 통해 배지를 여과합니다.
   3. 배양 SMM18 마우스 ES 세포는 이전에 설명된 바와 같이 유지 보수 배지에서 6cm 접시에 대해 Mom2 메큐에 태프프프를 두드린 것으로,^18. 2-3일마다 통과합니다.
2. 세럼 없는 분화(SFD) 매체의 준비
   1. 기초 SFD: 햄의 F-12의 250 mL, 750 mL의 이스코브의 수정 된 덜벡코의 매체 (IMDM), B27 보충제 마이너스 비타민 A, N2 보충제 5mL, L-alanine-L-글루타민 10mL, 인산완충식살린(PBS)의 10% 소 세럼 알부민 5mL, 페니실린 및 연쇄상구(10,000 U/mL). 0.22 μm 여과기를 통해 걸이하여 살균합니다.
   2. 증류수에 5 mg/mL에 아스코르브산을 녹이고 0.22 μm 스트레이너를 통해 걸러하여 멸균합니다.
   3. 1-티오글리세롤의 13 μL을 IMDM 1mL로 희석하십시오. 본명, 이 희석된 1-티오글리세롤을 MTG로 지칭한다.
   4. 사용 당일 아스코르브산 10μL(5mg/mL) 및 MTG 3μL을 기초 SFD 1mL에 추가합니다. 본명에서, 완전한 SFD로 이 혼합물을 지칭한다.
3. 0일차, 분화를 위한 배아체(EB) 형성
   1. 재조합 트립신 과 같은 프로테아제 (rTrypsin)와 SMM18 마우스 ES 세포를 수확하고 세포를 계산합니다.
   2. 원심분리기 5 x 10 5 셀300 x 10⁵ 세포는 4 °C에서 3 분 동안 3 분 동안 3 분, 완전한 SFD의 10 mL에서 재중단하고 10cm 페트리 접시로 시드합니다. 세포를 37°C및 50h에 대해 5%_CO2로 배양한다.
4. 차별화일 2
   1. 액티빈 A, 인간 혈관 내피 성장 인자(hVEGF), 및 뼈 형태유전학 단백질 4(BMP4)를 추가하여 각각 5 ng/mL, 5 ng/mL 및 1.9 ng/mL의 최종 농도로 SFD를 완료합니다.
      참고: BMP4 농도는 BMP4의 부지에 따라 다를 수 있습니다. 새로운 부지를 사용하기 전에 소규모 시험에서 여러 농도를 테스트하고 심장 분화를위한 최상의 농도를 결정합니다.
   2. 페트리 접시에서 15mL 튜브로 EB를 옮기고 원심분리기는 50-100 x g에서 4°C에서 3분 동안 전달합니다.
   3. 한편, 페트리 접시에 1.4.1 단계에서 준비된 배지를 추가하여 나머지 EB가 건조해지는 것을 보호합니다.
   4. 15mL 튜브에서 상류체를 흡인하고, 페트리 접시의 배지로 EB를 재연하고, EB 용액을 접시로 다시 옮기. 이어서, 46h에 대해 37°C 및 5%_CO2에서 EB를 경작한다.
5. 차별화일 4
   1. 10cm 조직 배양 처리 접시에 5~10mL의 0.1% 젤라틴을 5분 이상 젤라틴으로 젤라틴화한다. 세포 를 파종하기 직전에 흡인 젤라틴.
   2. 준비 매체: 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), FGF10 및 hVEGF를 혼합하여 각각 5 ng/mL, 25 ng/mL 및 5 ng/mL 최종 농도에서 SFD를 완료합니다. 10cm 의 접시를 원하면 10mL를 준비하십시오.
   3. 페트리 접시에서 15mL 튜브로 세포를 옮기십시오. 페트리 접시에 PBS 5mL을 추가하고, 여러 번 씻고, 나머지 세포를 수집하기 위해 15mL 튜브로 옮겨넣습니다. 50-100 x g, 4 °C, 3 분에서 원심 분리기.
   4. 흡인 슈퍼네티드, r트립신 1mL를 추가하고 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
   5. 소용돌이는 간략하게 EB를 해리하고, 10% FBS 배지의 9mL를 추가하고, 다시 소용돌이를 추가하고, 세포를 계산한다.
   6. 원심분리기 1.5 x 10⁷ 셀300 x g, 4°C 3분, 1.4.2 단계에서 제조된 매체로 재일시 중단하고 젤라틴화 접시에 종자한다. 2 일 동안 37 °C 및 5 % CO_2에서 배양하십시오.
      참고: 7일 또는 8일째에는 PSC-CM의 광범위한 구타를 관찰할 수 있습니다.
6. 차분일 7일과 9일에 약물 선택: 분화의 7일과 9일에 비심근구를 제거하기 위해 푸오마이신(최종 농도에서 2 μg/mL)으로 미디어를 다시 공급한다.
   참고: SMM18의 부모 라인은 syNP4 마우스 ES 세포로, NCX1 프로모터 구동 푸오마이신 내성^{유전자(20)를}수용한다.
7. 10일차, 향후 실험을 위한 재플레이트
   1. 유리 바닥 배양 플레이트 또는 0.1% 젤라틴으로 폴리머 커버슬립을 함유한 35mm 이미징 접시를 코팅합니다. 성숙을 향상시키기 위해 라미닌-511 E8 조각(LN511-E8)으로 접시를 실온^18에서30-60분 동안 1 μg/cm^2로 코팅합니다. 특정 관심 패턴의 PSC-CM을 배양하려면 폴리디메틸실록산(PDMS) 우표를 준비하기 위한 4단계와 5단계를 참조하십시오.
   2. SMM18 PSC-CM을 수확하려면 PBS로 접시를 두 번 씻고, r트립신 1mL을 바르고, 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
   3. 10% FBS 배지의 9mL에서 세포를 수집, 일시 중단, 및 세포를 계산. 35mm 이미징 접시에 있는 24웰 플레이트 또는 250,000-500,000 세포의 한 우물에서 50,000-100,000 세포에 세포를 접시.
   4. 원심 분리는 충분한 수의 세포(300 x g, 3분)를 원심분리하고 FBS(최종 농도 10%)로 보충된 완전한 SFD로 세포를 재연한다.
   5. 하룻밤 동안 배양하고 푸오마이신으로 SFD를 완료하기 위해 문화 매체를 변경합니다.
   6. 14일부터 Mom2-RFP가 눈에 띄는 경우, 14일부터 21일부터 28일까지 완전한 SFD를 통해 문화 매체를 일주일에 2~3회 변경합니다. 형광 태그 사컴 레 단백질의 AAV 기반 변환의 경우, 3 단계를 참조하십시오.

2. 인간 만능 줄기 세포의 분화

1. 차별화 미디어 준비
   1. RPMI +B27-Ins: 500mL의 RPMI 1640 배지, B27 의 10 mL 마이너스 인슐린, L-알라닌-L-글루타민 5.25 mL를 혼합합니다.
   2. RPMI +B27+Ins: 500mL의 RPMI, 10mL 의 B27 보충제, L-알라닌-L-글루타민 5.25 mL를 혼합합니다.
2. 인간 iPS 세포의 유지 보수
   1. 통로 인간 iPS 세포는 LN511-E8에 AK02N을 가진 주^2회일부 수정(21)을 가진 이전에 발표된 방법에 따른다.
   2. r트립신의 3 분 치료와 세포를 수확하고 10 % FBS 배지로 수집합니다. 세포와 원심분리기를 300 x g에서 4°C에서 3분 동안 계산합니다. 종자 75,000-125,000 종자 75,000-125,000 종자 AK02N의 2mL와 AK02N의 2mL와 각각 0.5 μg/mL (0.1 μg/cm²⁾및 10 μM의 최종 농도에 6 웰 플레이트의 1 개의 우물 에서 세포.
   3. 37°C 및 5% CO_2에서 배양하고 다음 날 배지를 AK02N 2mL로 대체하여 어떤 보충제도 없이 교체한다. 2~3일마다 미디어를 변경하고 3~4일마다 통과합니다.
3. 일 -4: 차별화 전 재플레이트
   1. PBS에서 희석된 LN511-E8의 0.5 μg/cm^2의 6웰 플레이트를 코팅합니다. 이어서, 실온에서 37°C에서 30분 이상, 5% CO₂ 또는 1시간 동안 배양한다. 파종 세포 바로 전에 흡인 코팅 솔루션.
   2. r트립신으로 인간 iPS 세포를 수확하고 2.2.2 단계에서와 같이 세포를 계산합니다.
   3. 원심분리기 1.25 x 10^5셀은 LN511-E8(최종 농도 0.5 μg/mL 또는 0.1 μg/cm²⁾및 Y27632(최종 농도 당 0.1 μg/cm 2)와 Y27632(최종 농도 0.1μg/cm 2)로 보충된 AK02N의 2mL에서 300 x g에서 6웰 플레이트의 우물용 300 x 105 세포로 재연한다.
   4. 흡혈성 코팅 용액, 종자 는 코팅 된 플레이트에 세포를 다시 중단하고 37 ° C 및 5 % CO_2에서배양한다.
4. 일 -3 및 -1: AK02N의 2mL로 매체를 교체하십시오.
5. 0일: 비질을 RPMI+B27-Ins 2mL로 교체하여 양당 CHIR99021(최종 농도 6 μM)으로 보충하여 차별화를 시작합니다.
6. 2일차: 중간형 편을 RPMI+B27-Ins2mL로 잘 교체합니다.
7. 4일: 매체를 RPMI+B27-Ins당 2mL로 교체합니다.
8. 7일차와 9일: PSC-CM을 선택적으로 배양하기 위해 심미/B27+In을 2mL로 대체합니다.
   참고: ACTN2-mCherry 라인, 이 연구에 사용, 내부 리보소말 항목 사이트의 카세트 (IRES), TNNT2 로큐의 3′un번역 영역 (UTR)에 삽입 된 puromycin 내성 유전자, 그리고 mCherry ACTN2의 정지 코동을 대체. 노크없이 심근구를 정화하려면 3 단계와 4 단계를 참조하십시오.
9. 10일차: 향후 실험을 위한 재플레이트
   1. LN511-E8의 0.5-1 μg/cm^2의 폴리머 커버슬립이 있는 35mm 이미징 접시를 0.1% 젤라틴으로 희석시 코팅합니다. 장기 생존을 위해 실온에서 2-4 h를 배양합니다. 원하는 패턴의 PSC-CM을 문화하려면 PDMS 스탬프를 준비하기 위한 4단계와 5단계를 참조하십시오.
   2. 인간 PSC-CM을 수확하려면 PBS로 접시를 두 번 씻고, 1mL의 rTrypsin을 잘 바르고, 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
   3. 10% FBS 배지의 4mL에서 세포를 수집, 일시 중단, 및 세포를 계산. 35mm 이미징 접시당 250,000-500,000개의 세포를 플레이트.
   4. 원심분리기는 4°C에서 3분 동안 300 x g의 충분한 수의 세포를, 푸오마이신(10 μg/mL)을 곁들인 RPMI+B27+Ins로 재연하고, 코팅된 35mm 이미징 접시에 플레이트를 제공합니다.
   5. 하룻밤 동안 배양. 다음 아침, 배양 매체를 RPMI+B27+Ins로 푸오마이신(10 μg/mL)으로 바꿉니다.
   6. 14일부터 는 영상 촬영시 21-28일까지 RPMI+B27+Ins로 문화 배지를 일주일에 2-3회 변경합니다. 형광 태그 사컴 레 단백질의 AAV 기반 변환의 경우, 3 단계를 참조하십시오.

3. 아데노 관련 바이러스를 사용하여 사혜성 라벨링

1. AAV 생산 전 준비
   1. 10cm 조직 배양판에 FBS(최종 농도 10%)로 보충된 DMEM에서 HEK293T 세포를 유지한다. 통로 세포는 일주일에 세 번.
   2. 폴리에틸렌민 (PEI)을 1 mg / mL에서 준비하십시오. 폴리에틸렌민 MAX 40000 과 40 mL의 초순수 수를 50 mg 혼합하십시오. 1 N NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 그런 다음, 0.22 μm 스트레이너를 통해 초순수수로 50mL까지 최종 부피를 만들고 필터를 드십시오.
   3. 심장 트로포닌 T(cTNT)^22와같은 심근세포 특이적 프로모터에 의해 구동되는 정모 세포 단백질 [GFP]와 융합된 사코메르 라벨링 유전자(예를 들어, TCAP 또는 PDLIM3)를 사용하여 셔틀 벡터를 준비한다.
      참고 : 이 경우, 우리는 V163A, S202T, L221V^23의돌연변이와 단황 향상 GFP를 사용했다.
2. 0일차, 헤크 세포 통로
   1. 세포가 합류에 도달하면, 통과 2.0 x 10⁷ HEK293T 세포를 15cm 조직 배양 플레이트에 10% FBS를 가진 DMEM20mL.
3. 1일차, 트랜스펙트
   1. 셔틀 벡터의 13.5 μg, pHelper 26 μg(아데노바이러스의 벡터 코딩 E2A, E4 및 VA), pRC6의 16.5 μg(AAV2 Rep 및 AAV6 캡 유전자) 및 피루바테 나트륨(DMEM-Pyr)없이 DMEM 1mL을 혼합합니다.
   2. PEI 224 μL(1 mg/mL, 단계 3.1.2에서 제조) 및 DMEM-Pyr776 μL을 혼합합니다.
   3. 플라스미드 솔루션과 PEI 용액을 실온에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다.
   4. 3.2단계에서 제조된 HEK293T 세포에 플라스미드/PEI 용액을 추가합니다.
4. 2일차, 중간 변화
   1. 24h에서 트랜스페션 후, 배지를 DMEM-Pyr로 변경합니다. 7일째에 AAV를 수확할 때까지 세포를 배양합니다. AAV는 문화 매체에 공개될 예정입니다.
5. 7일차, 최소한의^{정화법(24)을} 이용한 AAV 수집, 농도 및 완충제 대체
   1. 원심 초여과 장치(100k 분자량 컷오프[MWCO])를 실온에서 PBS에서 1% BSA의 5mL로 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 초여분 부를 500 x g에서 2분 동안 원심분리하고 필터링된 솔루션과 나머지 솔루션을 모두 흡인시합니다.
   2. AAV를 생산한 15cm 접시에서 새로운 50mL 원심관및 원심분리기(500 x g, 5분)로 배지를 전달합니다. 0.45 μm 주사기 스트레이너를 통해 상체를 필터링하여 셀 이물질을 제거하고 초음파 여과 장치에 서스펜션을 적용합니다.
   3. 90 분 동안 또는 문화 상류체 0.5 ~ 1 mL을 집중 할 때까지 2000 x g에서 원심 분리기.
   4. 여과를 흡기하고 15mL의 PBS를 초여분 장치에 적용합니다.
   5. 농축액이 0.5-1mL가 될 때까지 원심분리를 반복합니다.
   6. 3.5.4 및 3.5.5를 반복합니다.
   7. 농축 된 AAV를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 4 ° C 또는 -20 ° C에 저장하십시오.
      참고: AAV는 P1 시설에서 사용할 수 있지만 현지 규칙 및 규정을 따릅니다. AAV는 기존의 방법에 의해서도 제조될 수 있다.
6. AAV 티터 계산
   1. AAV 5 μL, DMEM-Pyr195 μL, 벤조나아제 10U를 37°C에서 1시간 동안 혼합합니다.
   2. 단백질라제 K 버퍼 200 μL(0.02 M Tris HCl 및 1% SDS)과 5 μL의 단백질Ase K(20 mg/mL)를 넣고 37°C에서 1h로 배양합니다.
   3. 조심스럽게 25:24:1 페놀/클로로폼/이소아밀 알코올 용액의 400 μL을 조심스럽게 준비하고, 1분 동안 소용돌이, 원심분리기는 20,000 x g에서 1분 동안 준비합니다.
   4. 수성 상200 μL을 새로운 1.5mL 튜브로 전송하여 원래 AAV 게놈의 약 절반을 산출합니다.
   5. 글리코겐(20 mg/mL)의 1μL을 3M CH₃COONa(pH 5.2) 및 소용돌이의 20 μL에 추가합니다. 2-프로판놀 250 μL을 100% 에탄올과 소용돌이의 100 μL에 다시 넣습니다.
   6. -80°C에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 4 °C에서 30 분 동안 20,000 x g에서 원심 분리기.
   7. 수퍼내포를 흡인하고 튜브에 70% 에탄올을 추가합니다. 이어서, 원심분리기는 20,000 x g, 5분 동안 4°C입니다.
   8. 펠릿이 맑아질 때까지 초수체와 공기 건조를 흡인합니다.
   9. AAV 게놈을 해결하기 위해 트리스-에틸렌디아민테트라아세산(TE; pH 8.0)의 200μL를 추가한다. 그런 다음, 샘플을 TE로 100 배 희석시 희석시.
   10. 10⁹ 벡터 게놈 (vg)/μL을 얻기 위해 TE와 함께 6.5 ng /μL에서 pAAV-CMV-벡터로 표준을 준비합니다. 그런 다음 TE로 10^4에서 10^8까지 10 배 희석시리즈를 만듭니다.
   11. 샘플 DNA(또는 표준), 프라이머 0.4 μL(5 μM), 증류수 3.6 μL, SYBR 그린 마스터 믹스 5 μL을 혼합합니다. 프라이머, ITR에 위치, 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ 및 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
   12. 다음 조건으로 실시간 PCR을 수행 : 60 s에 대한 95 °C에서 초기 변성, 15 초에 대한 95 ° C에서 40 사이클, 30 초에 대한 60 ° C에서 어닐링 및 확장, 녹는 곡선에 이어.
   13. 표준 및 Ct 값에 따라 실시간 PCR 기계는 샘플의 1 μL에서 벡터 게놈의 복사 수를 제공합니다. 다음 방정식을 사용하여 원래 AAV 티터를 계산: 실시간 PCR (vg/μL) x 8 x 10³ x 2, AAV 게놈 격리 동안 희석 계수로 8 x 10^3, AAV (단일 가닥) 및 플라스미드 (이중 가닥)의 차이 계수로 2.
7. PSC-CM으로의 변환
   1. 추가 우물 또는 여분의 접시에 PSC-CM을 계산합니다.
   2. PBS로 50 μL을 구성하도록 AAV(1 x 10⁴ ~ 1 x 10⁶ vg/cell)를 희석합니다. 마우스 및 인간 PSC-CM에 대한 해당 분화 매체에서 AAV를 사용하여 3일 동안 PSC-C 및 배양 PSC-C에 1 x 10⁴ ~ 1 x 10⁶ vg/셀의 복합감염(MOI)에 AAV를 적용한 다음 AAV 없이 배양 배지로 미디어를 변경한다.
   3. 7일 이상 후 실시간 세포 이미징에 PSC-CM을 사용합니다.

4. [선택 사항] PsC-CM의 AAV 기반 정제

1. AAV 준비
   1. cTNT 프로모터의 통제 하에 블라실시딘 내성 유전자를 발현하는 셔틀 벡터를 사용하여 3단계에서 설명된 바와 같이 AAV를 준비한다.
2. iPS 세포 분화로의 전환
   1. 2단계에서 설명된 프로토콜에 따라 4일 동안 인간 iPS 세포를 분화하고 세포의 수를 더 잘 계산한다.
   2. 4일째에 매체를 변경한 후, 1 x 10⁵ vg/셀의 MOI에서 RPMI+B27-Ins 미디어에서 PC를 차별화하는 AAV를 적용합니다.
   3. 7일째에는 RPMI+B27+Ins로 배지를 새로 고치고 2.5-10 μg/mL의 블라시딘을 추가합니다.
   4. 10일째되는 날, PSC-CM은 재플레이트를 할 준비가 되어 있습니다.

5. PDMS 우표 준비

1. 컴퓨터 지원 설계(CAD) 도면 소프트웨어를 사용하여 스트립 사이에 10-25 μm 홈과 함께 200 μm 스트립의 장치 패턴을 디자인합니다.
2. 마스크리스 리소그래피 공구의 UV 광을 사용하여 AZP1350으로 코팅된 크롬 포토마스크에 장치의 패턴을 그립니다.
3. 포토마스크의 패턴을 일련의 포지티브 포토레지스트 개발자(예: 크롬 에탕트)에서 개발하고 DI 물로 헹구는 다.
4. 120°C에서 15분 동안 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 탈수합니다.
5. 웨이퍼가 실온으로 냉각되고 양수 포토레지스트 SU-8 3010을 스핀 코트로 시원하게 하여 스핀 코터를 사용하여 30s에 대해 1500rpm으로 10-20 μm의 높이를 만듭니다.
6. 제조업체의 프로토콜에 따라 핫 플레이트에서 웨이퍼를 두 단계로 부드럽게 구워줍니다.
7. 웨이퍼가 실온으로 냉각된 후 웨이퍼를 마스크 정렬기위에 로드합니다.
8. 마스크 정렬기를 사용하여 웨이퍼의 마스크를 정렬하고 웨이퍼를 UV 광에 노출시합니다.
9. 제조업체의 프로토콜에 따라 핫 플레이트의 두 단계로 웨이퍼에 노출 후 굽기를 수행합니다.
10. 일련의 SU-8 개발자와 2-프로파놀에서 웨이퍼를 개발한 다음 질소 스트림으로 웨이퍼를 건조시다.
11. 웨이퍼를 적당한 크기의 페트리 접시에 옮기.
12. PDMS 엘라스토머와 경화제를 10:1 w/w로 섞어 페트리 접시에 붓습니다.
13. 모든 기포가 사라질 때까지 PDMS를 건조기에서 탈가스한 다음 80°C에서 80°C에서 2시간 동안 PDMS를 치료합니다.
14. 트위저를 사용하여 마스터 몰드에서 경화 된 PDMS를 벗긴 다음 PDMS 스탬프로 설계로 부분을 잘라냅니다.
    참고: 모양은 정사각형일 수 있지만 팔각형 모양이 가장자리에서 패턴을 더 잘 전달합니다.

6. 다능성 줄기 세포 유래 심근세포의 패턴 배양

1. 수선 테이프를 사용하여 PDMS 우표 표면에서 먼지를 제거합니다.
2. 스탬프를 70% 에탄올에 담그고 멸균합니다. 그런 다음, 공기 먼지를 사용하여 우표의 표면에서 에탄올을 날려.
3. PDMS 우표 표면에 0.5 wt% 2-메하크릴로일로세틸 인스포릴콜린(MPC) 폴리머/에탄올의 5-10 μL을 적용한다.
   참고: MPC 폴리머의 고르지 않은 분포는 패턴이 중단될 수 있습니다.
4. MPC 폴리머가 완전히 건조 될 때까지 10-30 분 인큐베이션하십시오.
5. 스탬프는 유리 바닥 배양 판의 커버립또는 폴리머 커버슬립이 있는 35mm 이미징 접시와 접촉하여 스탬프에 10분 동안 스탬프에 가중치(예: AAA 배터리)를 넣습니다.
6. 무게와 우표를 제거합니다. 이어서, 그 패턴이 현미경으로 전달되었는지 확인한다.
   참고: 스탬프가 찍힌 접시/접시는 실온에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
7. PBS로 스탬프가 찍힌 우물/요리를 두 번 씻으셔도 됩니다.
8. 2-4 μg/mL에서 PBS로 LN511-E8을 희석하고 LN511-E8로 0.5-1 μg/cm^2로접시를 코팅한다. 인간 PSC-CM의 경우 PBS 대신 0.1% 젤라틴 솔루션으로 LN511-E8을 희석하십시오. 그런 다음 적어도 1 h (최적으로 4 시간 이상)에 대한 배양하십시오.
9. 플레이트 셀은 이전 섹션에 설명된 바와 같이.

7. 형광 현미경에서 사컴레스의 시간 경과 이미징

1. 켜고 현미경, 관련 컴퓨터 및 필요한 모든 주변 장치를 연결합니다.
2. 시간 경과 이미징을 수행하려면 가장 높은 배율(오일 에머젼이 있는 100X 객관적 렌즈)로 시간 경과 이미지를 캡처합니다.
3. 실시간 이미징 조건을 선택합니다. 좋은 대표 데이터를 얻으려면 가장 높은 프레임 레이트 (초당 최소 20 ms 또는 50 프레임 권장)에 적응하십시오. 셔터를 열고 필요한 비닝(4 X 4)과 획득 영역의 자르기를 적용하여 시간 경과 이미징 중에 이미지 간의 가장 짧은 간격을 달성합니다.
   참고: 설정은 현미경의 구성에 따라 달라질 수 있습니다. 카메라는 고감도여야 하며 데이터를 연결된 PC로 충분히 빠르게 전송할 수 있습니다. 이를 위해 카메라 링크와 함께 ORCA 플래시를 사용했습니다. 우리는 회전 공초점 현미경 검사를 하고 초당 400 프레임에서 심상을 획득했습니다.
   1. [선택 사항] 세포의 구타 속도가 낮으면 전기장 자극에 의해 세포를 연상시킵니다.
4. 시간 경과 기록 실행
   1. 시간 경과 이미지를 기록하는 동안 이미지필드가 포커스를 유지하도록 합니다.
   2. 시간 경과 이미지를 적절한 폴더에 저장합니다.

8. SarcOptiM을 사용하여 시간 경과 이미징 분석, ImageJ / 피지 플러그인

1. 일련의 타임랩스 이미지를 ImageJ에 로드합니다. 올림푸스 VSI 형식의 경우 올림푸스뷰어 플러그인을 통해 파일을 엽니다.
2. 이미지의 밝기와 대비를 조정하여 사코리어 패턴을 명확하게 관찰합니다(이미지| 조정 | 밝기/대비).
3. 더 많은 도구 메뉴(>>)를 클릭하고 SarcOptiM을 선택하여 SarcOptiM을 엽니다.
4. 도구 모음에 Ctrl + Shift + P 및 1 μm 버튼을 누르고 대화 상자의 지시에 따라 프로그램을 보정합니다.
5. 사컴레 단축을 측정하는 데 사용되는 사컴레 지역에 선을 그립니다.
6. 도구 모음에서 SingleCell(AVI)을 눌러 sarcomere 단축 분석을 시작합니다. 대표 데이터는 도 1 및 그림 2에표시됩니다.

노크인 PSC-CM 기자 라인을 사용하여 sarcomere 단축 측정. Sarcomere 라벨PSC-CM은 사코름 단축을 측정하는 데 사용되었습니다. 이 라인은 내인성 로시에서 Myom2-RFP 및 ACTN2-mCherry를 표현합니다. TagRFP는 M라인으로 국소화되는 M-단백질을 코딩하는 M-단백질을 코딩하는 Myom2에삽입되었으며, mCherry는 ACTN2에노크하고, 코딩 α-액티닌은 Z라인18,25로국소화되었다. 타임랩스 이미지는 피규어 1과 2및 영화 1-3에제시된 바와 같이 사컴레 단축을 결정하는 데 사용되었다.

PSC-CM의 무질서한 사코머를 극복하기 위해 특정 PDMS 스탬프는 스트라이프 패턴의 PSC-CM을 배양하는 데 사용되었습니다. 이러한 패턴 배양은 비패턴 영역에서 배양된 세포에 비해 길쭉한 세포 형상과 보다 조직화된 사코메어 패턴을 촉진하였다(그림2B 및 2C). 이러한 장점을 바탕으로, 패턴 배양은 세포의 더 나은 수축을 촉진하고 영화 2 및 3 및 도 2D에도시된 것처럼 매끄러운 사레 길이 프로파일을 제공했다.

AAV 벡터를 사용하여 Z 라인 단백질의 형광 태깅. 노크인 iPS 세포를 생성하지 않고 PSC-CM의 Z 라인을 시각화하기 위해 형광 태그Z 라인 단백질은 AAV 트랜스듀션을 사용하여 발현하였다. GFP를 이용한 두 개의 소형 Z라인 단백질인 텔레토닌(TCAP)과 액틴 관련 LIM 단백질(PDLIM3)은 AAV6 캡시드(도3A)를사용하여 태그및 포장하였다. PSC-CM이 분화되고 정제되면 AAV는 PSC-CM(그림3B)으로변환되었습니다. 변형된 PSC-CM은 3일 후 PSC-CM을 따라 육종GFP 신호를 발현하였다(그림3C 및 3D). 전형적으로,105 vg/세포의 MOI에서 AAV의 변환은 형광 태그 사코메르 단백질을 시각화하기에 충분하며, 더 높은 티터는 전체 GFP 강도를 증가하지만 세포질에 GFP의 비특이적 국소화를 유발할 수 있다.

AAV 벡터를 사용하여 PSC-CM의 정화. 현재 방법은 PSC-CM의 게놈에 이미 있는 약물 선택 카세트에 의존합니다, 형질전환 또는 노크 인 라인. 그러나, 환자 유래 iPS 세포로부터 이러한 라인을 생성하는 것은 노동 집약적이다. AAV 벡터는 노크인의 필요 없이 형광 표지 Z라인 단백질의 발현을 유도하는 것으로 입증되었기 때문에, 우리는 노크인(도4)없이정화 방법을 확립하고자 노력했다. 이를 위해, cTNT 프로모터의 통제 하에 블라실시딘 내성 유전자를 인코딩하는 새로운 AAV 벡터가 시공되었다(도4A). AAV(105 vg/셀의 MOI)는 4일째인간 iPS 세포를 분화하도록 유도하였다. 이어서 세포는 7일과 9일(도4B)사이에 블라스팅시딘(각 세포주에 대해 적정염이 필요)의 2.5-10 μg/mL로 처리하였다. 14일째PSC-CM의 순도는 90%(그림4C)를넘었다.

도 1: 묘2-TagRFP 세포주에서 유래된 마우스 PSC-CM의 사코머 단축. A. 마우스 PSC-CM 분화를 위한 타임라인입니다. B. 노란색 막대로 표시된 측정 영역과 다른 시간 지점에서 sarcomere 단축을 위한 대표적인 이미지입니다. 스케일 바 = 10 μm. C. 1Hz에서 전기로 자극된 심근세포의 수축 시 Sarcomere 길이 프로파일. 프레임 레이트는 초당 50 프레임이었습니다. 픽셀 크기는 0.26 μm이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 비패턴 및 패턴 배양에서 ACTN2-mCherry 세포주에서 유래된 인간 PSC-CM의 사코머 단축을 보여주는 대표적인 데이터. A. 인간 PSC-CM 분화를 위한 타임라인입니다. B. 및 C. 패턴이 없는 배양에서 배양된 심근세포는 무질서한 사르코프레 패턴(B)을 나타내며 패턴화된 배양은 사르코프레(C)의 좋은 정렬을 촉진한다. 노란색 막대가 제시한 측정 영역입니다. D. 0.5Hz의 전기 자극에 의해 유도된 세포 수축 시 얻어진 상응하는 sarcomere 길이 프로파일과 초당 100프레임. 픽셀 크기 = 0.26 μm, 스케일 바 = 10 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 3: 3 일 동안 AAV 변환 후 마우스 PSC-CM. A. 사컴 라벨링을 위한 AAV의 회로도 벡터 맵입니다. sarcomere 단백질 (관심의 유전자, GOI)는 글리 글리 글리 -Ser 링커 (L)와 GFP에 연결하고 심장 트로포닌 T (cTNT) 프로모터의 통제하에 표현된다. B. 마우스 PSC-CM 분화 및 AAV 변환에 대한 타임라인입니다. C. 및 D. Myom2-TagRFP 세포주에서 생성된 PSC-C로 3일간의 트랜스퍼배후 TCAP-GFP(C) 및 PDLIM3-GFP(D)의 명확한 사코머 길이 프로파일과 선명한 사코머 길이 프로파일을 보여주는 대표적인 이미지. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 노크 -에없이 인간의 PSC -C의 블라스팅 딘 정화. 
A. 블라시시딘 저항 유전자 카세트(BSR)가 cTNT 프로모터에 하류로 삽입되는 AAV의 회로도 벡터 맵. B. 인간 PSC-CM 분화, 변환 및 블라시딘 선택의 타임라인입니다. C. 인간 PSC-CM에서 cTNT + 세포의 백분율을 보여주는 대표적인 데이터(4일째에105 vg/셀 AAV6를 변환한 다음 7일과 9일에 2.5 μg/mL 블라실시딘으로 처리). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 1: Myom2-TagRFP 셀주에서 생성된 마우스 PSC-CM의 형광 시간 경과 비디오. RFP 신호는 28일 동안 PSC-CM 배양 후 사코레 패턴을 보였다. 세포는 1Hz에서 전기로 자극할 때 동기적으로 구타하는 것으로 나타났습니다. 타임랩스 이미지는 100X 렌즈로 20ms마다 획득되었습니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

영화 2: 비패턴 문화 접시에 배양 ACTN2-mCherry와 인간의 PSC-C의 형광 시간 경과 비디오. 비패턴 문화 접시에 ACTN2-mCherry를 표현하는 PSC-CM은 사코머의 해체뿐만 아니라 흔들리는 수축을 보였으며, 이는 사코머 단축을 결정하기 가 어렵습니다. 세포는 0.5Hz에서 전기로 자극되었고 이미지는 100X 렌즈로 10ms마다 획득했습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

영화 3: 액트N2-mCherry가 패턴 문화 접시에 배양된 인간 PSC-CM의 형광 시간 경과 비디오. 패턴 배양은 사코메어의 정렬을 촉진하고 막대 모양으로 세포를 강제로. 이 방법을 통해 PSC-CM의 sarcomere 단축을 보다 쉽게 결정할 수 있었습니다. 비디오는 0.5 Hz에서 전기로 세포를 자극하여 획득했습니다. 프레임 레이트는 초당 100 프레임이었습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 CAD 파일. 200 μm 폭의 스트립과 10 μm (Stamp_200x10.dxf), 25 μm (Stamp_200x25.dxf), 50 μm (Stamp_200x50.dxf)의 홈이있는 스탬프를 만들기위한 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

H.U.는 이 원고와 관련된 특허를 출원했습니다.