이 방법은 형광 태그 sarcomere 단백질을 가진 다능한 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 sarcomere 단축을 검사하는 것을 이용할 수 있습니다.
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방법 논문
형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.
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이 논문에서
요약
초록
다능성 줄기 세포 유래 심근세포(PSC-CM)는 배아 및 유도된 다능성 줄기(ES/iPS) 세포 모두에서 생성될 수 있다. 이 세포는 심장 질병 모델링을 위한 유망한 근원을 제공합니다. 심근병증의 경우, sarcomere 단축은 성인 심근세포와 함께 질병 표현형을 검사하는 표준 생리학적 평가 중 하나입니다. 그러나, 사용 가능한 방법은 PSC-CM의 수축도 평가하기에 적합하지 않습니다, 이러한 세포는 위상 대비 현미경 검사의 밑에 보이지 않는 저개발 사코메레스가 있기 때문에. 이 문제를 해결하고 PSC-CM을 사용하여 sarcomere 단축을 수행하기 위해 형광 태그 사코레 단백질및 형광 라이브 이미징이 사용되었습니다. 얇은 Z 라인과 M 라인은 각각 사마레의 양쪽 끝과 중앙에 있습니다. Z라인 단백질 -α-액티닌(ACTN2), 텔레토닌(TCAP), 액틴 관련 LIM 단백질(PDLIM3) 및 1개의 M라인 단백질—묘메신-2(Myom2) -는 형광 단백질로 태그하였다. 이러한 태그된 단백질은 내인성 대립구도에서 노크인또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 발현될 수 있다. 여기서는 마우스와 인간 만능 줄기 세포를 심근세포로 분화하고, AAV를 생산하고, 라이브 이미징을 수행하고 분석하는 방법을 소개합니다. 또한 형광 태그 단백질로 sarcomere 단축의 분석을 용이하게 PSC-CM의 패턴 문화에 대한 폴리디메틸실록산 (PDMS) 우표를 생산하는 방법을 설명합니다. 사컴 단축을 평가하기 위해 박동 세포의 시간 경과 이미지는 전기 자극(0.5-1Hz)에서 높은 프레임레이트(초당 50-100 프레임)로 기록되었다. 셀 수축 과정에서 사코메 길이를 분석하기 위해, 기록된 타임랩스 이미지는 ImageJ/Fiji의 플러그인인 SarcOptiM을 적용하였다. 우리의 전략은 PSC-CM에서 심장 질환 표현형을 조사하기위한 간단한 플랫폼을 제공합니다.
서론
심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률의 주요원인이며 심근병증은 심장 관련 사망의 세 번째 원인을 나타낸다2. 심근병증은 심장 근육에 영향을 미치는 질병의 집단 그룹입니다. 유도 된 다능성 줄기 (iPS) 세포와 심근 세포 (PSC-CM)를 향한 iPS 세포의 지시 분화의 최근 개발은 심근병증의 체외 모델로 환자 게놈으로 심근세포를 연구하기위한 문을 열었습니다. 이들 세포는 심장 질환의 병리생리학을 이해하고, 분자 메커니즘을 해명하고, 다른 치료 후보3을테스트하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 환자 유래 iPS 세포가 생성되었다(예를 들어, 비대성 심근병증 [HCM]4,5,부정맥 우심심근병증 [ARVC]6,확장된 심근병증 [DCM]7,및 미토콘드리아 관련 심근병증,미토콘드리아관련 심근병증이있다. 심근병증의 특성 중 하나는 sarcomeres의 기능 장애 및 ....
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프로토콜
1. 마우스 다능성 줄기 세포의 분화
- 마우스 ES 셀의 유지 보수
- 유지 보수 매체: 50mL의 태아 소 세럼(FBS), L-Alanine-L-글루타민 5mL, 비필수 아미노산(NEAA), 5mL 100mM 나트륨 피루바테, 55mMM 2-메르카포에타놀 909 μl(450m MM) 최소 450m)를 혼합합니다. 백혈병 억제 인자(LIF), CHIR-99021 및 PD0325901을 각각 1000 U/mL, 1 μM 및 3 μM의 최종 농도로 보충합니다. 0.22 μm 필터를 통해 배지를 살균합니다.
- FBS 배지: 55mL의 FBS, L-알라닌-L-글루타민 5.5mL, 피루바테 나트륨 5.5mL, 그리고 5.5mL의 NEAA에서 500mL까지 덜벡코의 수정이글 매체(DMEM) 높은 포도당. 멸균하기 위해 0.22 μm 필터를 통해 배지를 여과합니다.
- 배양 SMM18 마우스 ES 세포는 이전에 설명된 바와 같이 유지 보수 배지에서 6cm 접시에 대해 Mom2 메큐에 태프프프를 두드린 것으로,18. 2-3일마다 통과합니다.
- 세럼 없는 분화(SFD) 매체의 준비
- 기초 SFD: 햄의 F-12의 250 mL, 750 mL의....
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결과
노크인 PSC-CM 기자 라인을 사용하여 sarcomere 단축 측정. Sarcomere 라벨PSC-CM은 사코름 단축을 측정하는 데 사용되었습니다. 이 라인은 내인성 로시에서 Myom2-RFP 및 ACTN2-mCherry를 표현합니다. TagRFP는 M라인으로 국소화되는 M-단백질을 코딩하는 M-단백질을 코딩하는 Myom2에삽입되었으며, mCherry는 ACTN2에노크하고, 코딩 α-액티닌은 Z라인18,25로국소화되었다. 타임랩스 이미지는 피규어 1과 2및 영화 1-3에제시된 바와 같이 사컴레 단축을 결정하는 데 사용되었다.
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토론
PSC-CM은 심장 질환을 모델링하고 약물의 효과를 테스트하기 위해 시험관 내 플랫폼으로 활용 될 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 PSC-CM 기능을 평가하는 정확하고 통일된 방법을 먼저 수립해야 합니다. 대부분의 기능성 검사는 PSC-CM, 예를 들어 전기생리학, 칼슘 과도 및 신진대사(26)와함께 작동하며, 최초의 환자 유래 PSC-CM 연구 중 하나는 긴 QT 증후군27에관한 것이었다. 그러나, 수축, 심근 세포의 가장 중요 한 기능 중 하나, 여전히 평가 하기 어렵다. 성인용 심근세포로, 사코프레 단축이 널리 사용됩니다. 대조적으로, PSC-CM의 저개발 및 무질서한 sarcomere 때문에, sarcomere 단축을 위한 표준 방법은 이 세포와 함께 작동하지 않습니다. 따라서, 우리는 형광 태그 sarcomere 단백질을 사용하여 PSC-CM에 있는 sarcomere 단축을 검토하기 위한 대체 방.......
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공개 사항
H.U.는 이 원고와 관련된 특허를 출원했습니다.
감사의 글
우리는 도움이 토론및 기술 지원을 위해 지치 의과 대학의 재생 의학 부서의 모든 실험실 구성원을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 의학 연구 개발 (AMED)에 대한 일본 기관의 보조금에 의해 지원되었다; JP18bm0704012 및 JP20bm0804018), 일본과학진흥협회(JSPS; JP19KK0219, 일본순환학회(기초연구보조금)
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