여기에 제시된 미오신 5a를 발현하고 정화하는 절차이며, 체외 형광 현미경 기반 의 앙상블 과 단일 분자를 모두 사용하여 이러한 방법이 비근육 근신 2b의 특성화를 위해 어떻게 수정될 수 있는지에 대한 논의가 뒤따릅니다.
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이 논문에서
요약
초록
Myosin 단백질 결합 하 고 필라멘트 액 틴 (F-actin)와 상호 작용 하 고 phylogenetic 나무를 통해 유기 체에서 발견 된다. 그들의 구조와 효소 특성은 셀에서 실행하는 특정 기능에 맞게 조정됩니다. Myosin 5a 는 세포에서 멜라노솜과 소포를 수송하기 위해 F-actin을 가공적으로 걷습니다. 반대로, 비근육 미오신 2b는 약 30개의 분자를 포함하는 양극성 필라멘트로 작동합니다. 그것은 근신 분자가 액틴을 결합하고, 파워 스트로크를 부여하고, 주기를 반복하기 전에 해리하기 위해 비동기적으로 작동하는 필라멘트의 중심으로 반대 극성의 F-actin을 이동합니다. 비근육 근신 2b는 다른 비근육 근신 2 동종포형태와 함께 세포 접착, 세포키네시스 및 장력 유지를 포함하는 역할을 합니다. 미신의 메카노케미케는 정제된 단백질을 사용하여 체외 운동성 작용을 수행하여 연구할 수 있습니다. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서, myosins는 현미경 커버슬립 표면에 묶여 있고 형광으로 표지된 F-actin을 변환합니다, 이는 추적될 수 있습니다. 단일 분자/앙상블 운동성 분석에서, 그러나, F-actin은 F-actin에 형광표지 된 미신 분자의 커버슬립 및 운동에 결합된다. 본 보고서에서, 친화성 크로마토그래피를 이용한 Sf9 세포로부터의 재조합 묘신 5a의 정제가 설명되어 있다. 이 다음, 우리는 두 형광 현미경 기반 분석법을 설명합니다: 글라이딩 액틴 필라멘트 분석및 반전된 운동성 분석. 이러한 분석에서 액틴 전좌 속도 및 단일 분자 실행 길이 및 속도와 같은 매개 변수는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추출될 수 있다. 이러한 기술은 또한 비근육 근신 2 동종의 단일 필라멘트의 움직임을 연구하기 위해 적용될 수 있으며, 비근육 근신 2b의 맥락에서 본원에 논의된다. 이 워크플로우는 비근육 myosins의 단일 분자 및 앙상블 역학을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 및 정량적 도구 집합을 나타냅니다.
서론
묘신은 아데노신 삼위산염(ATP) 가수분해1에서유래한 에너지를 이용하여 액틴 필라멘트에 힘을 발휘하는 모터 단백질이다. 미신에는 머리, 목 및 꼬리 도메인이 포함되어 있습니다. 헤드 도메인에는 액틴 결합 영역뿐만 아니라 ATP 바인딩 및 가수 분해 사이트가 포함되어 있습니다. 목 도메인은 광 사슬, 칼모둘린 또는 칼모둘린과 같은 단백질2,3에결합하는 IQ 모티브로 구성됩니다. 상기 tail 영역은 두 개의 무거운 사슬의 이압, 화물 분자의 결합, 헤드 도메인과의 자동 억제 작용을 통한 미신의 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 미오신의 각 클래스에 특정한 여러 기능을갖는다.
미오신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다릅니다. 이러한 특성 중 일부는 듀티 비율(myosin이 액틴에 바인딩되는 myosin의 기계적 사이클의 일부)과 처리성(분리 전에 트랙에서 여러 단계를 하는 모터의 능력)을 포함한다.4. 미신의 40개 이상의 클래스는 서열 분석5,
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프로토콜
1. 단백질 정제
- 세포 리시스 및 단백질 추출
- 표 1을기반으로 1.5배 추출 버퍼를 준비합니다. 4°C에서 필터를 하고 보관하십시오.
- 얼음에 세포 펠릿을 해동 시작합니다. 펠릿이 해동하는 동안 1.2 mM 디티오트리톨(DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0.5 μM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 및 2개의 프로테아제 억제제 정제를 통해 100mL의 추출 버퍼를 보충하십시오. 얼음을 유지합니다.
- 펠릿이 해동되면 세포 배양 10mL당 보충 추출 버퍼 1mL을 추가하십시오. 예를 들어, 세포 펠릿이 세포 배양 500mL로부터 형성된 경우, 펠릿에 50mL의 보충 추출 버퍼를 추가한다.
- 얼음 위에 보관하면서 세포 펠릿을 초음파 처리합니다. 각 펠릿에 대해 다음 조건을 사용합니다: 5 s ON, 5 s OFF, 5분, 전원 4-5.
- 모든 균질화된 용액을 비커로 수집하고 ATP(0.1M 스톡 솔루션; pH 7.0)를 추가하여 ATP의 최종 농도가 1mM입니다. 차가운 방에서 15 분 동안 저어줍니다. ATP는 활성 미오신을 액틴으로부터 분리하여 다음 원심 분리 단계에서 분리할 수 있도록 합니다. 따라서 ATP 고갈 및 액틴 재구속 가능성을 최소화하....
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결과
미오신의 정제는 도2에 도시된 바와 같이 나트륨 도데딜 황산염-폴리아크라이글라미드(SDS-PAGE) 겔-전기포아를 감소시킴으로써 평가될 수 있다. 이 수치는 최종, 투석 후 myosin을 나타내지만, SDS-PAGE는 상체에 손실된 모든 제품을 식별하기 위해 정화 절차의 다양한 단계에서 알리쿼트에서 수행될 수 있다. 묘신 5a HMM은 120-130 kDa 범위에서 밴드를 가지고 있으며, 전체 길이 무근육 미오신 2b는 200-230 kDa 범위에서 밴드가 있으며, 중형 체인29,44에해당한다. 미신 5a는 또한 칼모둘린을 표시하는 17 kDa 마크 근처에 밴드가 있습니다. 비근육 미오신 2b는 ELC를 나타내는 약 17 kDa의 밴드가 있습니다. GFP 태그RLC는 이 NM2b 준비에 존재하기 때문에 RLC는 약 47 kDa에 나타납니다. 그러나, 표호되지 않은 RLC는.......
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토론
여기에 제시된 미오신 5a 및 비근육 미오신 2b의 정제 및 체외 특성화를 위한 워크플로우가 있습니다. 이 실험 세트는 정제된 myosin 구조의 메카노케미컬 특성을 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 데 유용합니다. 여기에 표시된 두 개의 myosins는 많은 가능성에서 단지 두 가지 특정 예이지만, 조건과 기술은 대부분의 myosins및 다른 많은 모터 단백질에, 일부 재단과 함께 적용 될 수있다.
여기에서 설명하는 프로토콜은 실험실 및 실험의 개별 요구에 따라 변형될 수 있습니다. 예를 들어, 발현 및 분자 생물학 섹션에서 설명한 바와 같이, 이 논문에 사용된 단백질은 두 개 이상의 바이러스의 공동 감염으로부터 생성되었다; 그러나, 성공적인 단백질 발현은 p-FastBac 이중 발현 벡터 또는 BiGBac 발현시스템(53)과같은 다발성 벡터로달성될 수 있다.
몇몇 요인은 재조합 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 데이터 수집에 사용되는 시약의 준비와 함께 기술 지원을 준 Fang Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NHLBI / NIH 교내 연구 프로그램 기금 HL001786J.R.S.에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 주사기 | BD | 309628 | |
| 2 M CaCl2 Solution | VWR | 10128-558 | |
| 2 M MgCl2 Solution | VWR | 10128-298 | |
| 27 게이지 니들 | Becton Dickinson | 309623 | |
| 5 M NaCl 용액 | KD Medical | RGE-3270 | |
| Acetic Acid | ThermoFisher Scientific | 984303 | |
| Amyl Acetate | Ladd Research Industries | 10825 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | Millipore Sigma | A2220 | |
| https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| Biotinylated G-Actin | Cytoskeleton, Inc. | AB07 | |
| 소 혈청 알부민 | Millipore 시그마 | 5470 | |
| bPEG-실란 | Laysan Bio, Inc | 비오틴-PEG-SIL-3400-1g | |
| Bradford 시약 농축액 | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calmodulin | PMID: 2985564 | ||
| Catalase | Millipore Sigma | C40 | |
| Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf | |
| 원형 여과지 - 글라이딩 분석 | Millipore Sigma | WHA1001125 | |
| 원형 여과지 - Inverted Assay | Millipore Sigma | WHA1001090 | |
| cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets | Millipore Sigma | 5056489001 | 이것은 4°C에서 보관해야 합니다. 정제는 직접 사용하거나 1 정제를 2mL의 증류수에 용해시켜 25x 스톡 용액으로 재구성할 수 있습니다. 결과 용액은 4°C에 저장할 수 있습니다. C 1-2주 동안 또는 최소 12주 동안 -20 °C. |
| Concentrating Tubes (100,000 MWCO) | EMD Millipore Corporation | UFC910024 | MWCO가 정제되는 단백질의 총 분자량보다 작은 한, 튜브의 MWCO가 반드시 "모든 사람에게 적합한" 것은 아닙니다. 본원의 NM2b는 100,000 MWCO 튜브로 농축되었고, M5a는 30,000 MWCO 튜브로 농축되었다. |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Coverslip Rack | Millipore Sigma | Z688568-1EA | |
| strong>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay | VWR International | 48366-227 | |
| Coverslips: Inverted Motility Assay | Azer Scientific | ES0107052 | |
| 투석 튜브(3500 Dalton MCWO) | Fischer Scientific | 08-670-5A | 투석 튜브의 직경은 다를 수 있지만 MWCO는 동일해야 합니다. 본원에 사용된 NM2b는 18mm 투석관에서 투석되었습니다. 튜브는 4°C에서 20% 알코올 용액에 보관할 수 있습니다. |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D0632 | |
| 양면 테이프 | Office Depot | 909955 | |
| DYKDDDDK 펩타이드 | GenScript | RP10586 | 이는 0.1M NaCl, 0.1mM EGTA, 3mM NaN3 및 10mM MOPS(pH 7.2)를 포함하는 완충액에 용해되어 최종 농도 50mg/mL까지 용해될 수 있습니다. 이것은 -20 °에 저장할 수 있습니다. C as 300 &마이크로; L 분취량. |
| EGTA | Millipore Sigma | E4378 | |
| Elution Column | Bio-Rad | 761-1550 | 재사용이 가능합니다. 청소하려면 2-3 컬럼 부피의 PBS와 증류수로 컬럼을 헹굽니다. 열을 4°에서 식히십시오. C 사용하기 전에. |
| Ethanol | Fischer Scientific | A4094 | |
| G-actin | PMID: | 4254541 G-actin 재고는 200 μ 액체 N2의 M. | |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
| Glucose Oxidase | Millipore Sigma | G2133 | |
| Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-295018 | |
| HaloTag | Promega | G100A | |
| HCl | Millipore Sigma | 320331 | |
| KCl | Fischer Scientific | P217-500 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fischer Scientific | 02-707-134 | |
| Leupeptin 프로테아제 억제제 | ThermoFisher Scientific | 78435 | |
| Mark12 염색되지 않은 표준 사다리 | ThermoFisher Scientific | LC5677 | |
| 메탄올 | Millipore Sigma | MX0482 | |
| Methylcellulose | Millipore Sigma | M0512 | |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
| MOPS | Fischer Scientific | BP308-100 | |
| PEG-silane | Laysan Bio, Inc | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Myosin Light Chain Kinase | PMID: 23148220 | FLAG-tagged MLCK는 본 명세서에서 FLAG-tagged myosin이 정제된 것과 동일한 방식으로 정제될 수 있습니다. | |
| NaN3 | Millipore Sigma | S8032 | |
| NeutrAvidin | ThermoFisher Scientific | 31050 | |
| 니트로셀룰로오스 | Ladd Research Industries | 10800 | |
| NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323PK2 | |
| NuPAGE LDS 시료 완충액(4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| 인산염 완충 식염수, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| PMSF | Millipore Sigma | 78830 | PMSF는 이소프로판올에서 0.1M 원액으로 만들 수 있으며 4°C에 저장할 수 있습니다. 이소프로판올을 첨가하면 결정 침전이 발생하며, 이는 실온에서 교반하여 용해될 수 있습니다. 사용 직전에 PMSF를 빠르게 교반하는 용액에 최종 농도 0.1mM까지 적가할 수 있습니다. |
| Razor Blades | Office Depot | 397492 | |
| Rhodamine-Phalloidin | ThermoFisher Scientific | R415 | 스톡은 100% 메탄올에 최종 농도 200μm까지 희석할 수 있습니다. |
| Sf9 Media | ThermoFisher Scientific | 12658-027 | 이것은 4°C에서 보관해야 합니다. 유통 기한은 제조일로부터 18개월입니다. |
| Tissue Culture Dish - Gliding Assay | Corning | 353025 | 각 조직 배양 접시는 약 9개의 커버슬립을 담을 수 있습니다. |
| Tissue Culture Dish - Inverted Assay | Corning | 353003 | 각 조직 배양 접시는 약 4개의 커버슬립을 담을 수 있습니다. |
| <강한>부드러운 양면 200 &마이크로; L 피펫 팁 | Thomas Scientific | 1158U38 | |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006590 | |
| T현미경 | Nikon | 모델: 100x TIRF 대물렌즈가 있는 H-TIRF 시스템을 사용한 Eclipse Ti(N.A. 1.49) | |
| Microscope 카메라 | Andor | 모델: iXon DU888 EMCCD 카메라 (1024 x 1024 센서 형식) | |
| Microscope Environmental Control Box | Tokai HIT | Custom Thermobox | |
| Microscope Laser Unit | Nikon | LU-n4 4 레이저 유닛 405nm, 488nm, 561nm, 640nm | |
| 용 고체 레이저가 있는Mid Bench Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 모델: CR3i | |
| Misonix Sonicator | Misonix | XL2020 | |
| Optima Max-XP 탁상용 초원심분리기 | Beckman Coulter | 393315 | |
| Plasma-Cleaner | Diener electronic GmbH + Co. KG | 시스템 유형 : Zepto | |
| Sonicator 프로브 (3.2mm) < / strong > | Qsonica | 4418 | |
| < strong > 표준 인큐베이터 < / strong > | 바인더 | 모델 : 56 | |
| < strong > Waverly 튜브 믹서 < / strong > | Waverly | TR6E | |
| < > SOFTWARE < / strong > | |||
| ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
| FAST(버전 1.01) | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements | FAST는 Mac OSX 및 Linux 기반 시스템에서 사용할 수 있습니다. | |
| 이미지 스태빌라이저 플러그인 | https://imagej.net/Image_Stabilizer | ||
| ImageJ TrackMate | https://imagej.net/TrackMate | ||
| 이미징 소프트웨어 | NIS 요소(AR 패키지) | ||
| http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | |||
| https://github.com/turalaksel/FASTrack | |||
| https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md |
참고문헌
- Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
- Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
- Rhoads, A. R., Friedberg, ....
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재인쇄 및 허가
