이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
살아있는 췌장 조직 조각은 그대로 있는 작은 액상 미세 환경의 맥락에서 islet 생리학 및 기능의 연구를 허용합니다. 슬라이스는 아가로즈에 내장된 살아있는 인간과 마우스 췌장 조직에서 제조되고 진동기를 사용하여 절단합니다. 이 방법을 사용하면 조직이 타입-1(T1D) 및 타입-2 당뇨병(T2D)과 같은 근본적인 병리를 보존하는 것 외에도 생존력과 기능을 유지할 수 있게 한다. 상기 슬라이스 방법은 췌장의 내분비 및 외신 조직을 포함하는 복잡한 구조및 각종 세포간 상호작용의 유지를 통해 췌장의 연구에서 새로운 방향을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 췌장 생리학의 평가와 함께 췌장 슬라이스 내에서 살아있는 내인성 면역 세포의 염색 및 시간 경과 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이러한 접근법은 주요 조직적합성 복합-다중머 시약을 사용하여 아슬레 세포 항원을 특이화하여 면역세포 집단을 분별하기 위해 정제될 수 있다.
서론
췌장의 참여는 췌장염, T1D 및 T2D1,2,3과 같은 질병에 대한 병증이다. 격리된 섬에서의 기능에 대한 연구는 일반적으로 주변 환경에서 섬을 제거하는 것을 포함한다4. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 그대로 있는 유일학 소환경을 유지하고 스트레스가 많은 아슬렛 격리 절차의 사용을 피하면서 췌장 조직의 연구를 가능하게 하기 위하여 개발되었다5,6,7. 인간 기증자 조직에서 췌장 조직 조각 은 성공적으로 T1D를 연구하는 데 사용되었으며 면역 세포 침투 외에 베타 세포 손실 및 기능 장애의 과정을 입증했습니다8,9,10,11,12,13.....
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프로토콜
참고 : 마우스를 사용하는 모든 실험 프로토콜은 플로리다 동물 관리 및 사용위원회 (201808642)의 대학에 의해 승인되었다. 두 남녀의 조직 기증자에서 인간의 췌장 섹션 당뇨병을 가진 췌장 장기 기증자에 대 한 네트워크를 통해 얻은 (nPOD) 조직 은행, 플로리다 대학. 인간 췌장은 장기 기증 법률 및 규정에 따라 nPOD와 협력하는 공인 기관 조달 조직에 의해 cadaveric 장기 기증자로부터 수확되었으며 플로리다 대학 기관 검토 위원회 (IRB) (IRB No. 392-2008)에 의해 "비 인간 과목"으로 분류되어 동의의 필요성을 포기했습니다. 이 프로젝트에 특별히 사용되는 nPOD 조직은 플로리다 IRB 대학 (IRB20140093)에 의해 비인간적 인 것으로 승인되었습니다. 이 프로토콜의 섹션 1-3의 목적은 마우스를 성공적으로 해부하고 췌장을 준비하고 처리하고 살아있는 췌장 조직 조각을 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 솔루션은 미리 준비해야 하며, 레시피는 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다. 시간은 이러한 프로토콜 단계에서 가장 중요한 요소입니다. 마우스가 희생되면 조직 생존능력이 떨어지기 시작합니다. 이 프로토콜의 세 부분 모두 필요한 모든 조각이 생성될 때까지 가능한 한 빨리 완료해야 합니다.
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결과
이 프로토콜은 기능 성 연구 와 면역 세포 기록 모두에 적합한 살아있는 췌장 조직 조각을 산출합니다. 밝은 필드와 반사된 빛의 슬라이스 모양은 그림 1A, B에 표시됩니다. 논의된 바와 같이, 섬은 인슐린 함량(도 1C)으로 인해 발생하는 세분성 으로 인해 반사된 빛을 사용하여 슬라이스에서 발견될 수 있으며, 반사광이 사용될 때 배경 조직에 비해 명확하게 관찰된다. 생존 가능성은 슬라이스 생성 다음 평가되어야 하며, 섬의 20% 이상이 실행 가능하지 않은 경우 섬이 기록되어서는 안 됩니다. 생존가능성이 높은 이점은 도 1D에 표시되는 반면, 제대로 처리되지 않은 슬라이스의 예는 보충 도 1에 표시됩니다. 생존가능성이 낮은 섬은 무거운 SYTOX 블루 염색을 가지며, 조직은 죽은 세포의 스테인드 핵으로 덮여 있을.......
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토론
이 프로토콜의 목적은 기능및 면역학적 연구에서 슬라이스를 사용하는 데 필요한 췌장 슬라이스 생성과 절차를 구체화하는 것입니다. 라이브 췌장 슬라이스를 사용하는 데는 많은 이점이 있습니다. 그러나, 조직이 기술된 실험 프로토콜 도중 실행 가능하고 유용한 상태를 유지하는 데 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 신속하게 작업하는 것이 필수적입니다. 췌장을 주입하고 진동에 조각을 생성하는 사이의 시간의 길이는 조직의 생존력을 유지하기 위해 최소화되어야한다. 실온 ECS가 아닌 슬라이스하기 전에 췌장을 차가운 ECS에 보관함으로써 생존도 향상됩니다. 중요한 것은, 조각은 프로테아제 억제제없이 매체에 없어야합니다. 프로테아제 억제제 없이 슬라이스를 배양하면 생존율이 크게 감소합니다.
염료 로딩 중에 슬라이스가 억제제 없이 잠시 방치되었을 때, 높은 포도당에 대한 응답으로 Ca2+ 플럭스는 더 이상 기저 활성이 여전히 슬라이스에서 볼 수 있음에도 불구하고 기록될 수.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, P01 AI042288에 의해 지원되었다. 이 연구는 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크의 지원으로 수행되었습니다 (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)가 후원하는 공동 타입-1 당뇨병 연구 프로젝트, 레오나 M. & 해리 B. 헬름슬리 자선 신탁 (그랜트 #2018PG-T1D053). 표현된 내용과 견해는 저자의 책임이며 반드시 nPOD에 대한 공식 적인 견해를 반영하지는 않습니다. 연구 자원을 제공하기 위해 nPOD와 협력하는 장기 조달 조직 (OPO)은 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ 나열됩니다. 마우스 조각을 생성하는 데 사용되는 진동을 제공 해 준 플로리다 대학교 케빈 오토 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| # 3 스타일 메스 손잡이 | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES 완충액, 1M 용액 |
| 10cm 처리되지 않은 배양 접시 | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok 주사기 | BD | 301029 | BD 주사기 Luer-Lok 팁 27 |
| G 바늘 | BD | BD 305109 | BD 일반 사용 및 PrecisionGlide 피하 주사 바늘 |
| 35mm 커버 유리 바닥 페트리 접시 | Ibidi | 81156 | µ -접시 35mm, 높은 |
| 50mL 주사기 | BD | 309653 | |
| 8-웰 챔버 커버 글라스 | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a 항체 | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| 염화칼슘 | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| 염화칼슘 이수화물 | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| 컴팩트 디지털 로커 | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Leica | SP8 | 핀홀 = 1.5-2 통풍이 잘되는 단위; 512.에서 10x/0.40 개구수 HC PL APO CS2 건식 및 20x/0.75 개구수 HC PL APO CS2 건식 대물렌즈로 획득; &시간; &얇은sp; 512 픽셀 해상도 |
| D-(+)-포도 | 시그마 | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| 디티존 | 시그마-알드리치 | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | 디메틸 설폭사이드 |
| 에탄올 | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35mm 조직 배양 접시 | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip 조직 배양 접시 |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 수술용 블레이드 | 전자 현미경 과학 | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | 세포 투과성 Ca2+ 표시기 |
| 젤 제어 슈퍼 글루 | Loctite | 45198 | |
| Graefe 집게 | 파인 사이언스 도구 | 11049-10 | |
| 경화 파인 사이 | 도구 | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| 얼음 양동이 | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson 수의학 | NDC 14043-704-05 | |
| 존스 홉킨스 불독 클램프 | Roboz 수술 상점 | RS-7440 | 곧장; 500-900 그램 압력; 1.5" 길이 |
| Kimwipes Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech 과학&무역; 킴와이프스&트레이드; 섬세한 작업용 와이퍼, 2-플라이 | |
| LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트 | Invitrogen | L3224 | 이 키트에는 칼세인-AM 생세포 염료가 포함되어 있습니다. |
| 저포도당 DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| 염화마그네슘 육수화물 | 시그마 | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| 황산마그네슘 heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| 자기 가열 플랫폼 | Warner Instruments | PM-1 | 동적 자극을 위한 이미징 챔버용 플랫폼 녹음 |
| 마이크로파 | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene 주사기 필터 | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath 이미징 챔버 | Warner Instruments | RC-26 | 동적 자극 녹음용 이미징 챔버 |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | 세포 투과성 Ca2+ 인디케이터 |
| 오버나이트 이미징 챔버 | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | 슬라이스 생성을 위한 아가로스를 만들기 위해 |
| PE 표지 인슐린 테트라머 | Emory Tetramer Research 코어 | 서열 YAIENYLEL | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| 염화칼 | Sigma | P5405 | KCl |
| 인산칼륨 일염기 | 성 Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor | Blades Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; 양면 스테인리스강, 코팅되지 않은 |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque 저 융점 아가로스 | Lonza | 50101 | 슬라이스 생성을 위한 아가로스를 만들기 위해 |
| Slice 앵커 | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| 중탄산 나트륨 | 시그마 | S5761 | NaHCO3 |
| 염화나트륨 | 시그마 | S5886 | NaCl |
| 인산나트륨 일수화물 | 시그마 | S9638 | NaH2PO4 (일수화물) |
| 대두 트립신 억제제 | Sigma | T6522-1G | Glycine max (대두)의 트립신 억제제 |
| Stage 어댑터 | Warner Instruments | SA-20MW-AL | 현미경 스테이지에서 동적 자극 기록을 위한 이미징 챔버에 맞게 |
| 스테이지 상단 인큐베이터 | Okolab | H201 | |
| 스테레오스코프 | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | 청색 형광 핵산 염색 |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | 팔콘&트레이드; 플라스틱 일회용 전송 피펫 |
| 밸브 제어 시스템 | Warner Instruments | VCS-8 | 동적 자극 녹음용 시스템 |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| 수조 | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp 범용 디럭스 수조 GPD 02 |
참고문헌
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R.
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재인쇄 및 허가
