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Research Article
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
제시는 구조 기능 분석을 위한 기도, 폐포 및 간질 내세포의 위치를 보존하는 폐의 혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션을 위한 방법입니다. 지속적인 기도 압력은 공기 인플레이션 챔버로 유지되며 고정은 오른쪽 심실을 통해 퍼프됩니다. 폐는 히스토로지학 연구를 위해 처리됩니다.
폐 조직학은 폐 항상성 및 질병 병인 동안 영공 세포에 의해 제공된 기여를 조사하기 위하여 수시로 이용됩니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 주입 기반 고정 방법은 영공 세포와 점액을 말기 항공으로 대체할 수 있으며 조직 형태를 변경할 수 있습니다. 이에 비해 혈관 관류 고정 기술은 영공 및 점막 안대기 내의 세포의 위치와 형태를 보존하는 데 탁월합니다. 그러나, 양수기도 압력이 동시에 적용되지 않으면 폐의 영역이 붕괴될 수 있으며 모세혈관이 폐포 공간으로 팽창하여 폐 해부학의 왜곡으로 이어질 수 있다. 본명, 하류 조직학 연구를 위한 뮤린 폐내기도 및 폐포 세포 및 간질의 형태와 위치를 보존하기 위해 혈관 관류 고정 시 공기 인플레이션에 대한 저렴한 방법을 설명합니다. 일정한 기압은 고정이 오른쪽 심실을 통해 침투되는 동안 조절 가능한 액체 컬럼을 통해 압력을 유지하는 밀봉된 공기 채워진 챔버에서 기관을 통해 폐로 전달됩니다.
폐 공증은 건강과 질병 동안 폐 건축을 평가하기위한 금 본위제이며 폐 연구자1에의해 가장 일반적으로 사용되는 도구 중 하나입니다. 이 기술의 가장 중요한 양상 중 하나는 폐 조직의 적절한 격리 및 보존이며,이 단계의 가변성은 조직 품질 저하 및 잘못된 결과1,2,3로이어질 수 있기 때문이다. 살아있는 동물에서 폐 부피는 표면 장력에 의해 흉벽과 횡격막에서 전염되는 폐의 내탄 반동과 외부 력 사이의 균형에 의해 결정됩니다. 따라서 흉부에 들어가면 바깥쪽 힘이 손실되고 폐가 붕괴됩니다. 붕괴된 폐에서 제조된 히스토로지학적 섹션은 해부학 구획(즉, 영공, 혈관 및 간질)의 경계가 혼잡하여 구별하기 어려울 수 있다. 이 도전을 우회하기 위하여는, 연구원은 수시로 영공 규모 및 건축이 유지되도록 화학 고정 도중 폐를 팽창합니다.
폐는 공기 또는 액체로 팽창할 수 있습니다. 폐를 동일한 부피로 팽창시키는 데 필요한 압력은 공기-액체 인터페이스의 분자 간 힘으로 인해 공기 및 액체 인플레이션 간에 다릅니다. 표면 장력을 극복하고 붕괴된폐포4를열기 위해서는 액체 인플레이션(예를 들어, 12cmH 2O)보다 공기 인플레이션 시 고압(예를 들어, 25cmH2O)이필요합니다. 폐포를 모집하면, 낮은 압력은 압력 볼륨 곡선 고원과 동일한 부피로 폐포를 열어 둘 수 있으며, 압력은 파스칼의 법칙4,5,6,7,8에따라 폐 전체에 걸쳐 균등화될 수 있다.
폐 인플레이션과 고정의 두 가지 주요 방법은 히스토로지에 대한 뮤린 폐를 보존하기 위해 존재한다. 가장 일반적으로, 영공은 액체로 주입됩니다 - 종종 고정을 포함. 이 방법의 주요 장점은 상대적으로 쉽고 약간의 교육이 필요하다는 것입니다. 고정제의 내내 주입은 혈관에 초점을 맞추는 연구에서 선호될 수 있지만, 기관지를 통해 주입되는 액체는 근위기도 세포와 뮤신을 더 많은 실기 영공 영역으로 밀어 넣는 경향이 있는 반면, 공기 인플레이션은1,3,4,9,10,11을하지 않는다. 더욱이, 액체 인플레이션 시 상피로부터 백혈구의 부주의하게 분리하면 형태가 변하고, 관절학적으로 단순하고 둥근외관4,10,11,12를준다. 마지막으로, 액체를 가진 폐의 인플레이션은 의도하지 않게 중간4,10,11을압축할 수 있다. 함께, 이러한 요인은 보존 된 폐 내에서 정상적인 해부학 및 세포 분포를 왜곡 할 수 있습니다, 따라서 기술을 제한.
조직 보존의 다른 방법은 혈관 관류 고정입니다. 이 방법에서, 고정은 정맥 카바 또는 오른쪽 심실을 통해 폐 혈관으로 침투된다. 이 방법은 영공 루멘에서 세포의 위치와 형태를 보존합니다. 그러나 관류 고정 중에 폐가 팽창하지 않는 한 폐 조직이 붕괴 될 가능성이 있습니다.
혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션은 위의 각 고정 기술의 강점을 활용합니다. 본원에 우리는이 기술에 대한 프로토콜을 제공합니다. 필요한 재료와 장비는 상대적으로 저렴하며 쉽게 얻을 수 있고 조립할 수 있습니다. 도 1A에표시된 완성된 설정은 조절 가능한 유체 채워진 컬럼을 통해 폐에 일정한 기도 압력을 제공하며, 연동 펌프는 오른쪽 심실을 통해 고정을 제공합니다. 보존된 형태학을 가진 폐는 구조물 기능 분석을 위해 추가처리될 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명된 모든 방법은 국립 유태인 건강의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜은 세 가지 구성 요소로 구성됩니다. 첫 번째 구성 요소는 관류/고정 장비로 공기 인플레이션의 건설을 자세히 설명합니다. 두 번째 섹션에서는 실험을 위해 장비를 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막 섹션에서는 동물을 준비하고 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.
1. 물 기둥 장치의 건설(도 1B)
2. 공기 인플레이션 챔버의 건설(그림 1C)
3. 동물 가공 용기의 건설(도 1D)
4. 솔루션 준비
5. 관류 장치 준비
참고: 연동 펌프는 일정한 유량을 보장하기 위해 체액을 혈관으로 전달하는 것이 좋습니다. 다음 방향은 연동 펌프를 설정하기 위한 것이며 각 모델에 대해 다를 수 있습니다. 대안적으로, 연동 펌프를 사용할 수 없는 경우, 제2 수열 장치는 35cm H2O의높이로부터 유체를 퍼퓨즈하도록 구성될 수 있다.
6. 공기 인플레이션 장치 준비
7. 동물의 준비(그림 2)
참고 : 이 절차는 게이지 외13에서수정되었습니다. 우리는 다양한 연령대의 성인 남성과 여성 마우스에이 절차를 완료하고 나이 또는 성 편견을 주의하지 않습니다.
8. 공기 인플레이션, 관류 및 폐 고정(그림 2)
9. 폐 의 추출(그림 3)
그대로 흉부에서 폐는 흉막 공간을 통해 흉벽에 의해 적용된 바깥쪽 힘에 의해 개방된다6,14. 해부 중에 다이어프램이 입력되면 흉막 공간의 무결성이 폐지되고 폐가 붕괴되어야합니다(그림 2A,2B). 폐를 다시 확장하기 위해 공기 인플레이션이 수행됩니다. 첫 번째 단계로, 붕괴 된 영공의 모집을 보장하기 위해 25cm의 수압이 적용됩니다. 이에 따라, 동물 보유 용기 외부의 스톱콕이 열리면, 공기는 기관을 통해 폐로 유입되고 인플레이션을 쉽게 관찰해야한다(도 2C). 폐가 완전히 팽창하면 인플레이션 압력이 20cm의 수압(그림2D)으로감소합니다. 20cm의 수압은 폐의 완전한 인플레이션을 유지하지만 영공을 과도하게 변조하지 않기 때문에 선택됩니다.
폐는 기관 결찰 후 팽창된 상태로 유지되어야한다(도 3A)흉부에서 제거한 후(도3B). 폐의 디플레이션(도 3C)은폐가 동물 제제 또는 추출 중에 천공되는 경우 발생할 수 있습니다. 흉막 표면에 고정을 추가하면 시술 중에 사소한 누출을 밀봉하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 초과가 흉부 구멍에 폐를 부착 할 수 있기 때문에 고정을 신중하게 적용해야합니다. 고정 중에 밀봉되지 않은 누출은 공기 인플레이션 장치에서 제거되면 폐가 붕괴됩니다. 기관체가 완전히 묶여 있지 않은 경우에도 폐의 디플레이션이 발생할 수 있습니다. 고정에 잠수될 때, 제대로 팽창된 폐는 수축된 폐보다는 더 중대한 부력을 갖습니다.
팽창된 폐는 확립된 프로토콜1,15에따라 조직학적 분석을 위해 처리될 수 있다. 도 4의경우, 폐는 냉동 단면에 대해 가공되고 상용 수동 염색 시스템으로 염색되었다. 기존의 액체 계인플레이션(도 4A)을사용하여 고정된 조직의 기도 루멘에는 거의 면역 세포가 존재한다. 대조적으로, 염증 세포는 공기인플레이션(그림 4B)으로혈관 관류를 통해 고정된 조직에서 영공 전체에 보존된다.

그림 1: 장치 조립. A. 모든 장치의 전체 조립. B. 물 기둥은 180 PVC 튜브와 양방향 남성 루어를 통해 공기 인플레이션 챔버에 연결된 60 mL 주사기로 구성되어 있습니다. C. 500mL 밀봉 플라스틱 용기는 공기 인플레이션 챔버를 구성하는 데 사용되었다. 물 기둥의 수컷 루어는 챔버 의 벽 내에서 여성 루어에 연결된 스톱콕에 연결합니다. 추가 여성 Luer는 공기 인플레이션 챔버에서 동물 가공 용기에 튜브를 연결합니다. 두 여성 Luers모두 실리콘 개스킷 제조업체로 코팅되어 밀폐 씰을 보장합니다. 두 명의 수컷 Luers는 공기 인플레이션 챔버를 동물 처리 용기에 연결하는 튜브의 양쪽 끝에 연결되어 있습니다. D. 동물은 기관으로 구멍을 통해 배치 20G 루어 스텁 어댑터를 통해 공기 인플레이션 챔버에 부착됩니다. Luer 스텁 어댑터는 동물 가공 용기의 벽 안에 있는 암컷 루어와 연결되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 동물 제제, 공기 인플레이션 챔버와의 연결 및 폐의 인플레이션. A. 안락사 후, 동물의 복막과 흉부 구멍이 노출됩니다. 갈비 케이지는 제거되거나 아래로 고정되어 인플레이션 시 폐가 확장될 수 있습니다. Luer 스텁 어댑터는 기관으로 절단된 작은 구멍에 삽입되어 실이나 봉합사로 고정됩니다. Luer 스텁 어댑터는 동물 처리 챔버의 벽 내의 여성 루어와 연결되어 있습니다. 여성 루어의 다른 쪽 끝은 공기 인플레이션 챔버에서 공기 흐름을 제어하기 위해 스톱콕에 부착됩니다 (표시되지 않음). B. 공기 인플레이션 전에 폐가 붕괴되었습니다. C. 폐는 25cm의 수압으로 팽창하여 기민성 지역을 모집합니다. D. 압력이 의도된 고정 압력(20cm 물)으로 변경되면 폐가 약간 수축됩니다. 또한 25G x 5/8 바늘을 오른쪽 심실로 배치하여 폐의 혈관 관류 고정을 위해 묘사됩니다. 모든 이미지는 15.9 메가픽셀 해상도와 4:3 가로세로 촬영한 사진입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 혈관 관류 고정과 공기 인플레이션의 완료 에 따라 폐의 추출. A. 기관체는 루어 스텁 어댑터에 탈구되어 폐는 결합 조직 후방을 중질로 절단하여 추출됩니다. B. 성공적인 절차 완료 후 공기 팽창 폐. C. 공기 인플레이션 챔버 내에서 발생한 공기 누출로 인한 폐가 제대로 팽창되지 않은 예입니다. 이 폐는 성공적으로 팽창된 폐 보다는 더 작습니다 주의하십시오. 모든 이미지는 15.9 메가픽셀 해상도와 4:3 가로세로 촬영한 사진입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 혈관 관류 고정을 통해 공기 인플레이션 대 장내 기반 고정에 의해 얻은 폐 조직의 비교. A. 폐 내 고정에 의해 보존. B. 혈관 관류 고정으로 공기 인플레이션에 의해 보존된 폐. B(인세트). 화살표는 혈관 관류 고정에 의해 고정 된 폐의 기도에 백혈구를 보여줍니다; 별은 폐포에서 백혈구를 강조합니다. 이에 비해, 백혈구는 장내 충혈경로(A inset)를통해 고정된 폐의 기도에서 특히 결석하고 폐포 내 백혈구가 변위되어 상피 세포와 단단히 접촉하는 것으로 나타났다. 약어 : A- 기도, V- 선박. 이미지의 배율은 각각 A 및 B 인셋의 경우 40배, 200배입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
저자는 공개 할 것이 없습니다.
제시는 구조 기능 분석을 위한 기도, 폐포 및 간질 내세포의 위치를 보존하는 폐의 혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션을 위한 방법입니다. 지속적인 기도 압력은 공기 인플레이션 챔버로 유지되며 고정은 오른쪽 심실을 통해 퍼프됩니다. 폐는 히스토로지학 연구를 위해 처리됩니다.
이 작품은 국립 심장에 의해 투자되었다, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI) HL140039 및 HL130938을 부여. 저자는 섀넌 핫트와 자잘 맥클렌던의 기술적 전문성에 감사드립니다.
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