수확 및 분해 : 생물막 방법 연구에서 간과 된 단계

요약

이 논문에서는 두 가지 표면 유형에서 세 가지 일반적인 생물막 수확 및 분해 기술, 수확 방법의 견고성 테스트 및 재현성을 높이기 위해 수확 및 분해 기술을 선택하고 최적화 할 때 고려해야 할 최소 정보를 시연하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

초록

생물막 방법은 네 가지 별개의 단계로 구성됩니다: 관련 모델에서 생물막을 성장시키고, 성숙한 생물막을 처리하고, 표면으로부터 생물막을 수확하고, 덩어리를 분해하고, 샘플을 분석한다. 네 단계 중 수확과 분해는 가장 적게 연구되었지만 그럼에도 불구하고 테스트 편향의 가능성을 고려할 때 중요합니다. 이 기사는 세 가지 다른 표면에서 자란 생물막에 일반적으로 사용되는 수확 및 분해 기술을 보여줍니다. 광범위한 문헌 검토에서 수집 된 세 가지 생물막 수확 및 분해 기술에는 볼텍싱 및 초음파 처리, 긁기 및 균질화, 긁기, 볼텍싱 및 초음파 처리가 포함됩니다. 두 가지 표면 유형이 고려됩니다 : 경질 비 다공성 (폴리 카보네이트 및 붕규산염 유리)과 다공성 (실리콘). 또한 우리는 수확 기술을 보고 할 때 포함되어야하는 최소 정보에 대한 권장 사항과 편향을 검사하기위한 동반 방법을 제공합니다.

서론

생물막의 정의는 지난 수십 년 동안 진화해 왔으며 다양한 생물학적 및/또는 비생물학적 표면과의 미생물 연관성을 포함하며, 매트릭스 내에서 서로 다른 성장과 유전자 발현을 나타내는 비세포 성분^{1을 포함한다2}. 생물막은 건조와 같은 환경 스트레스로부터 보호를 제공하며 화학 소독제의 작용을 덜 효과적으로 만들어 미생물의 생존을 초래할 수 있습니다. 생물막 내의 생존자들은 잠재적으로 공중 보건 관심사인 병원성 미생물의 공급원을 제공할 수 있다³.

생물막 방법은 성장, 처리, 샘플링 (수확 및 분해) 및 분석의 네 단계로 구성됩니다. 사용자가 유기체 성장 조건, 온도, 배지 등을 결정하는 첫 번째 단계인 성장은 생물막 문헌4,5,6,7에서 가장 많이 고려되고 보고된다. 처리 단계는 성숙한 생물막^3,8,9에 대한 그들의 효능을 결정하기 위해 항미생물제 (예를....

프로토콜

1. 소용돌이 및 초음파 처리

1. 성숙한 P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 ASTM 표준 E25622에 따라 성장시켰다.
2. 48 시간의 성장 기간이 끝나면 ASTM 표준 E28718에 따라 생물막 및 샘플 쿠폰을 처리 할 준비를하십시오.
3. 무균적으로 오토클레이브 스플래시 가드를 화염 멸균된 포셉을 사용하여 멸균된 50mL 코니컬 튜브에 삽입합니다. 치료를받을 모든 튜브에 대해 반복하십시오. 제어 쿠폰 용 튜브에는 스플래시 가드가 필요하지 않습니다.
4. CDC 생물막 반응기로부터 무작위로 선택된 막대를 무균적으로 제거한다. 쿠폰을 헹구어 막대를 멸균 완충수 30mL에 부드럽게 담그어 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다.
5. 막대를 벤치 상단과 평행하게 잡고 비어있는 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓고 화염 살균 된 Allen 렌치를 사용하여 세트 나사를 풀어 바이오 필름 코팅 쿠폰을 튜브에 떨어 뜨립니다. 원하는 쿠폰 수에 대해 반복하십시오. 스플래시 가드를 제거하고 살균을 위해 별도의 용기에 넣으십시오.
6. 5 mL 혈청학적 피펫을 사용하여, 4 m....

결과

수확 방법의 검증/확인
우리 실험실에서 수행 된 여러 연구는 단일 튜브 방법 (ASTM E2871)⁸을 사용하여 생물막 반응기 (ASTM E2562)²에서 자란 생물막을 효과적으로 수확하기 위해 볼텍싱 및 초음파 처리 능력을 조사했습니다.

P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 보로실리케이트 유리 쿠폰 상에서 ASTM E25622에 따라 성장시켰다. 48시간 후, 4개의 쿠폰을 바이알에 넣고, 4 mL 멸균 완충수로 "처리"하고, 36 mL의 2x D/E 중화 브로스로 중화시켰다. 45kHz, 10% 전력, 스윕 설정, 30 ± 5 s의 초기 초음파 처리 설정을 사용하여 4개의 쿠폰 중 세 개로부터 생물막을 수확하고 분해하였다. 소용돌이 및 초음파 처리 사이클이 완료되면, 각 쿠폰을 크리.......

토론

수확 및 분해 방법에 대한 최소 정보
과학계에 걸쳐 재현 가능한 생물막 데이터를 작성하려면 저자가 생물막 방법의 성장, 치료, 샘플링 및 분석 단계에 대해 가능한 한 많은 세부 사항을 포함시켜야합니다. 생물막 방법의 표준화는 연구자가 특정 방법과 관련 수정을 참조 할 수있게 해주기 때문에 이러한 노력에 도움이되었습니다. 그러나 많은 논문에는 생물막 수확 및 분해를 설명하는 한 두 문장 만 포함되어 있습니다. 더 나은 재현성을 위해, 우리는 생물막 수확에 대한 최소한의 정보가 출판물에 포함되도록 권장합니다. 이것은 Lourenco et ^al.17이 제시 한 생물막 실험 (MIABiE)에 대한 최소 정보를 기반으로합니다. 생물막 수확 및 분해 매개 변수에 초음파 처리를 사용하는 경우 정보에는 욕조 내의 튜브 위치 (트랜스 듀서의 손상을 방지하기위한 제조업체의 권장 사항), 동시에 초음파 처리 된 튜브 수, 튜브 재료, 튜브 내 액체의 부피 및 유형, 계면.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50 mL 원뿔형 바이알	Thermo Scientific	339652
100 mL 유리 비커	Fisher Scientific	FB102100
5 mL 혈청학 피펫	Fisher Scientific	13-678-12D	쿠폰이 들어있는 바이알에 처리를 추가합니다.
50 mL 혈청학 피펫	Fisher Scientific	13-678-14C	처리 접촉 시간 종료 시 바이알에 중화제를 첨가합니다.
애플리케이터 스틱	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
금속 주걱	Fisher Scientific	14-373
PTFE 경찰관	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST 분산 도구	IKA	4446700	생물막 샘플의 균질화용.
가위	Fisher Scientific	08-951-20
실리콘 폴리 카테터, 크기 16 French	Medline Industries	DYND11502
실리콘 튜브, 크기 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX 분산기	IKA	3737001	생물막 시료의 균질화용.
튜브 커넥터	Cole-Parmer	EW02023-86
초음파 세척기	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 수직 50mL 튜브 홀더	Scientific Industries	SI-V506