이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.
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정오 공지
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요약
초록
지질 이중층은 세포막의 주요 매트릭스를 형성하고 영양 교환, 단백질 막 상호 작용 및 바이러스 성 신진을위한 기본 플랫폼입니다, 다른 중요한 세포 과정 중. 효율적인 생물학적 활동을 위해 세포막은 세포와 구획의 무결성을 유지할 수 있을 만큼 단단해야 하지만 단백질 및 기능성 도메인과 같은 멤브레인 성분이 확산되고 상호 작용할 수 있을 만큼 충분히 유연해야 합니다. 탄성 및 유체 막 특성의 섬세한 균형, 생물학적 기능에 미치는 영향은 주요 생물학적 과정의 장편 길이 및 시간 척도,즉 막 변형 및 단백질 결합 이벤트의 집단 막 역학에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. 이 동적 범위를 효과적으로 조사 할 수있는 기술 중 중 하나는 중성자 스핀 에코 (NSE) 분광법입니다. 중수소 라벨링과 결합된 NSE는 벤딩 및 두께 변동뿐만 아니라 선택 된 멤브레인 피처의 중전적 역학에 직접 액세스하는 데 사용할 수 있습니다. 이 백서는 NSE 기술에 대한 간략한 설명을 제공하고 샘플 준비 및 중음 체계의 세부 사항과 데이터 수집 및 감소에 대한 지침을 포함하여 리포소말 멤브레인에 대한 NSE 실험을 수행하는 절차를 간략하게 설명합니다. 또한 굴곡 강성 계수, 영역 압축성 계수 및 평면 점도와 같은 주요 멤브레인 파라미터를 추출하는 데 사용되는 데이터 분석 방법을 소개합니다. NSE 연구의 생물학적 중요성을 설명하기 위해 NSE가 조사한 멤브레인 현상의 예를 선택하여 멤브레인 굽힘 강성에 첨가제의 효과, 막 변동에 대한 도메인 형성의 영향 및 막 단백질 상호 작용의 동적 시그니처에 대해 논의됩니다.
서론
세포막과 그 기능에 대한 이해는 지난 수십 년 동안 현저하게 진화했습니다. 세포막의 이전 보기는 세포 경계와 집막단백질을 정의하는 수동 지질 양층으로 1은 점차 지질 이중층이 세포 신호, 분자 교환 및 단백질 기능을 포함한 중요한 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을하는 동적 모델로 점차 변형되어 몇가지 2,3,4,5,6의이름을 지정합니다. 세포막이 매우 역동적이고 지속적으로 리모델링 및 분자 재분배를 겪고 있다는 이러한 실현은 멤브레인7,8,9의평형 구조를 넘어 과학 탐사를 촉구했습니다. 이에 따라 생물학적 및 생체 영감 지질 막에서 다양한 동적 모드를 연구하기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었습니다. 현재까지, 이들 연구의 대부분은 주로 확산 분자 운동에 초점을 맞추고
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프로토콜
1. 실험에 필요한 신분 제도
- 변동 측정을 구부리기 위해 D2O(D 99.9%) 또는 D2O 버퍼(예: H2O 대신D2O로 제조된 인산염 버퍼)로 완전히 프로페드된 리포솜을 만듭니다. 133.4 mg으로 완전히 protiated DMPC (C36H72NO8P) 및 DSPC (C44H88NO8P)를
사용, 여기서 XDMPC와 XDSPC는 DMPC와 DSPC의 두더지 분수이며, 각각 0.7 및 0.3으로 설정하고 MwDMPC 및 MwDSPC는 각각 677.9 g/mol 및 790.1 g/mol이 제공하는 어금니 가중치입니다. 마찬가지로, mDSPC = 66.6 mg. 이러한 중음 방식은 멤브레인(NSLD ~ 0×10-6Å-2) 및 중음 버퍼(....
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결과
굽힘 변동에 액세스하는 NSE 연구는 일반적으로 ~ (0.04 - 0.2) Å-1의Q 범위에서 수행됩니다. 이 Q-range는 구부리다믹이 지배하는 멤브레인 두께와 리포소말 반경 사이의 중간 길이 스케일에 해당합니다. 확장된 Q-range를 측정하면 리포소말 확산 및 막 내 역학을 포함한 추가 동적 모드에 액세스할 수 있습니다. NSE에서 액세스하는 멤브레인 역학의 크로스 오버에 대한 자세한 내용은 이러한 관련 간행물25,71을확인하십시오. NSE 신호가 비례한다는 것을 강조하는 것이 
중요합니다:, 내가코와 나Inc.는 각각 샘플에서 일관되고 일관되지 않은 산란 강도입니다. 따라서, 주로 시료의 수소 함량에 의해 .......
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토론
NSE는 다양한 조건에서 지질 막의 중각역학을 측정하는 강력하고 독특한 기술입니다. NSE의 효과적인 활용은 샘플 품질, 중성자 대비 및 지정된 샘플에 대해 조사할 수 있는 접근 가능한 역학의 범위에 따라 달라집니다. 따라서 성공적인 NSE 실험을 수행하고 고품질 데이터를 수집하려면 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. NSE 실험 중 중성자 빔 시간을 효과적으로 사용하는 데 있어 중요한 단계는 NSE 실험 전에 실험실 기반 방법으로 리포소말 현탁액을 특성화하는 것이다. 압출 리포솜의 크기 분포(또는 확산 상수)는 다이나믹 라이트 산란(DLS)에 의해 결정될 수 있으며, 개별 실험실이나 공유 시설에서 쉽게 사용할 수있다(84). 극저온 전자 현미경 검사는 최근 리포소말 샘플에서 검증된 또 다른 탄성술 법으로, 리포소말 현탁액의 극저온 미세화 섹션에 대한 고해상도 현미경 이미지가 효과적으로 리포소플루65, 도메인 형성85,
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않으며 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
R. 아쉬카르 감사 M. 나가오, L.-R. Stingaciu, 그리고 P. Zolnierczuk 많은 유용한 토론과 그들의 각각의 빔라인에 NSE 실험에 그들의 빈번한 지원에 대 한. 저자는 NIST와 ORNL에서 중성자 스핀 에코 분광기의 사용을 인정합니다. NIST의 NSE 분광기는 국가 표준 기술 연구소와 국가 과학 재단 간의 파트너십인 고해상도 중성자 산란 센터의 지원을 받고 있습니다. DMR-1508249. ORNL의 Spallation 중성자 소스의 NSE 분광기는 미국 에너지부 기초 에너지 과학 부서인 과학 사용자 시설 부서에서 지원됩니다. 오크 리지 국립 연구소는 UT-Battelle에 의해 관리됩니다, 미국 DOE 계약 번호에 따라 LLC. DE-AC05-00OR22725.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 클로로포름 (생명 공학 급료) | Sigma Aldrich | 496189 | Biotech. 급료, ≥ 99.8 %, 안정제로 0.5-1.0 % 에탄올 함유 |
| 순환 수조 | Julabo | SE-12 | 가열 순환기 스마트 펌프, 프로그래밍 가능한 온도 설정 및 측정 및 제어를위한 외부 센서 연결 |
| 중수소 산화물 | Cambridge Isotopes Laboratories | DLM-4 | 중수소수; 중수(D2O) (D, 99.9%) |
| 디지털 세미 마이크로 저울 | Mettler Toledo | MS105 | 120 g 용량, 0.01 mg 해독도, 고해상도 칭량 셀, 인체공학적 도어 및 피펫 검사 어플리케이션을 갖춘 세미 마이크로 저울 |
| 에탄올(분자생물학 등급) | Sigma Aldrich | E7023 | 분자생물학 어플리케이션용 200 프루프 에탄올 |
| 유리 피펫 | VWR | 36360-536 | 일회용 소다 석회 유리 파스퇴르 피펫 |
| 유리 바이알 | Thermo Scientific | B7990-1 | PTFE/Silione 격막 캡이 있는 붕규산 유리 바이알 |
| 실험실 등급 냉동고 | Fisher Scientific | IU2886D | 지질 및 단백질의 장기 보관을 위한 초저온 냉동고(-86 - -50°C) |
| 지질(프로테이트 또는 투과) | Avanti 극성 지질 | 지질 | 에 따라 다릅니다.지질은 Avanti에서 분말 형태 또는 필요한 양과 중분화 계획과 함께 클로로포름 용액으로 구입할 수 있습니다. |
| Millipore 정수기 | Millipore Sigma | ZRQSVP3US | Direct-Q® 3 UV 정수 시스템은 내장 UV 램프로 순수와 초순수를 모두 제공하여 생물학적인 유기물 수준을 줄입니다. 응용 분야 |
| 미니 압출기 세트 | Avanti Polar Lipids | 610020 | 미니 압출기 세트에는 미니 압출기, 가열 블록, GasTight 주사기 2개, O-링 2개, 폴리카보네이트 멤브레인 및 필터 지지대가 포함되어 |
| 퀵 커넥트 피팅 | Grainger | 2YDA1 및 2YDA7 | 푸시 버튼 튜브 피팅은 QuickConnect 물 순환 애플리케이션(예: 고온 소포 압출 |
| 주사기 펌프 | )을 위한 것입니다.SyringePump.com | New Era-1000 | 주입 및 배출을 위한 완전 프로그래밍 가능한 주사기 펌프; 조정 가능한 펌핑 속도, 분주 용량 및 압출 주기로 최대 41개의 펌핑 단계를 프로그래밍 |
| 초음파 수조 | Fisher Scientific | CPX2800 | 탈기 및 초음파 응용 분야를 위한 프로그래밍 가능한 기능을 갖춘 온도 제어 초음파 수조 |
| 진공 오븐 | Thermo Scientific | 3608 | 0.7 cu ft 진공 오븐은 과열을 방지하는 상한 온도 조절 장치가 내장되어 |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | 부드러운 쉐이킹을 위한 낮은 rpm 시동 또는 샘플의 격렬한 와류를 위한 고속 혼합을 허용하는 가변 속도, 아날로그 제어 |
참고문헌
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual ....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: , where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
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NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: , where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.
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Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.
