세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

요약

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

초록

단백질 메틸 전달기(PRMTs)는 기질 단백질의 아르기닌 잔류물으로 메틸 군의 전달을 촉매한다. PRMT 제품군은 아르기닌 잔류물을 단백또는 대칭/비대칭으로 만들 수 있는 9명의 구성원으로 구성됩니다. 다양 한 단백질의 아르기닌 메 틸화의 다른 종류를 인식 하는 여러 항 체사용할 수 있습니다.; 따라서, PRMT 활성 바이오마커 의 개발을 위한 도구를 제공한다. PRMT 항체 기반 의 약은 겹치는 기판 및 모티프 기반 항체 특이성 때문에 도전적입니다. 이러한 문제와 개별 PRMT에 의해 기여 아르기닌 메틸화를 조사 하는 실험 설정 논의. 9개의 PRMT중 8개에 대한 바이오마커인 대표적인 기판의 신중한 선택을 통해 PRMT 활동 저술 패널이 설계되었다. 여기서, 세포 분석에 대한 프로토콜은 세포에서 PRMT 가족의 개별 구성원의 효소 활성을 정량적으로 측정하는 것으로 보고된다. 설명된 방법의 장점은 세포 배양 및 형광 웨스턴 블롯 기능을 가진 실험실에서 그들의 간단한 성과입니다. 기판 특이성 및 선택된 항체 신뢰성은 녹다운 및 과발현 접근법으로 완전히 검증되었다. 분석 바이오마커 및 항체의 상세한 지침 외에도 PRMT를 위한 억제제 도구 화합물 수집의 사용에 대한 정보도 제공됩니다.

서론

아르기닌 메틸화는 단백질-단백질 및 단백질-RNA 상호 작용을 조절하는 중요한 번역 후 변형으로, 따라서 사전 mRNA 접합, DNA 손상, 전사 반응 및 성장 인자 매개 변환^1,2와같은 다양한 세포 공정에서 중요한 역할을 한다. 아르기닌은 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라아제(PRMT)에 의해 메틸화되어 모노메틸 아르기닌(Rme1), 비대칭 디메틸라르기닌(Rme2a), 또는 대칭 디메틸라르기닌(Rme2s)^3을생성한다. 메틸화 유형에 기초하여, PRMT는 단일 및 비대칭 디메틸화를 촉매하는 유형 I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 및 8)의 세 그룹으로 분류됩니다. 모노 및 대칭 디메틸화를 촉매하는 유형 II (PRMT5 및 PRMT9); 및 유형 III (PRMT7), 이는 단지 단종 아르기닌^3을할 수 있습니다.

시판되는 아르기닌 메틸화 특이적 항체의 수가 증가함에 따라, PRMT 활성은 서양 블로팅을 사용하여 측정될 수 있다. 형광계 웨스턴 블롯은 더 큰 동적 범위와 선형성, 높은 감도, 멀티플렉스^4를허용하기 때문에 화학 발광 검출보다 바람직한 기술이다. 단백질 메틸화 수준을 정량화하려면 메틸화 신호의 정상화가 총 단백질 수준으로 정량화됩니다. 상이한 숙주 종(예를 들어, 마우스 및 토끼)에서 제기된 총 및 메틸화 단백질에 대한 항체를 선택함으로써, 상이한 형광으로 표지된 이차 항체를 사용할 수 있고 두 항체모두에 대한 신호가 동일한 샘플 대역에서 결정될 수 있다. 메틸-아르기닌 항체는 메틸 아르기닌이 특정 맥락에서 발견되는 단백, 비대칭 또는 대칭적으로 희석된 단백질을 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. PRMTs메틸레이트 글리신 및 아르기닌이 풍부한 모티프의 대다수가 기판⁵내에서 발생했기 때문에, 다름또는 비대칭, 대칭 디메틸-아르기닌 글리신 반복을 포함하는 펩티드에 대해 각각 D5A12, ASYM24 또는 ASYM25, 및 SYM111, SYM11, SYM11, SYM11 등이 들어 있었다. 다른 메틸-아르기닌 항체는 이러한 특정 문맥에서 메틸-아르기닌의 검출을 용이하게 하는 반복적인 맥락에서 비대칭, 대칭 디메틸 및 단메틸 아르기닌을 포함하는 펩티드 라이브러리에 대해 생성되었다^6. 또한 히스톤 H4R3me2a 또는 BAF155-R1064me2a와 같은 메틸화의 선택적 검출을 가능하게 하는 단일 단백질에 특정 아르기닌 마크를 인식하는 항체의 수가 증가하고 있다.

PRMT 세포 소의를 위한 공구로 이용될 수 있는 몇몇 상업적으로 유효한 PRMT 억제제가 있습니다. 그러나, 그들 모두는 철저하게 선택성과 오프 대상 효과에 대한 특성화하고 일부는주의해서 사용해야합니다. 구조 게놈 컨소시엄은 학술 실험실 및 제약 파트너와 협력하여 과학 계의 제한없이 사용할 수있는 강력하고 선택적이며 세포 투과성 PRMT 억제제 (화학 프로브)를 개발했습니다. 이러한 억제제에 대한 정보는 https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics 및 https://www.chemicalprobes.org/ 찾을 수 있습니다. 화학 프로브는 체외 IC₅₀ 또는 K_d < 100 nM을 가진 소분자 억제제, 동일한 패밀리의 단백질보다 30배 이상 선택성, 그리고 1 μM에서 의한 세포 활성을 추가로, 각 화학 프로브는 의도된 표적^{7,8,9,10,11,12에}대해 비활성인 근접 화학^{아날로그를}갖는다.

이 프로토콜의 목표는 형광 서부 블롯 방법을 사용하여 개별 PRMT 가족 구성원의 세포 활성을 측정하는 것입니다. 여기에서 검증된 분석 바이오마커, 항체 및 강력한 세포 활성 억제제에 대한 자세한 정보와 성공적인 분석 구현을 위한 귀중한 전략이 제공된다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 도금

참고: 권장 미디어를 갖춘 배양 세포와 마이코플라즈마 오염을 정기적으로 테스트합니다. HEK293T, MCF7 및 C2C12 세포는 이러한 세포주들이 PRMT 어약에서 성공적으로 사용되었기 때문에 예로 선택되었다.

1. DMEM의 문화 HEK293T, MCF7 및 C2C12는 10% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 U^mL-1),연쇄상 구균(100 μg^mL-1)으로10cm 조직 배양(TC) 요리로 보충하였다.
2. PRMT8 분석의 경우, 분석 개시 3일 전에 독시사이클린(2 μg/mL)을 함유한 매체에서 PRMT1 유도할 수 없는 녹다운 HEK293T 세포를 성장시한다.
3. 세포를 플레이트하려면 플레이트에서 미디어를 제거하고 폐기합니다.
4. 10mL의 PBS(Ca⁺² 및 Mg⁺² 이온 제외)를 추가하여 세포를 세척하고 용액을 폐기합니다.
5. 트립신-EDTA(0.25%)의 mL 1mL를 추가한 다음 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 용액을 폐기합니다. 세포가 둥글게 될 때까지 배양하고 접시에서 분리합니다. 필요한 경우 접시를 눌러 세포를 분리합니다. C2C12와 같은 시도하기 어려운 세포를 위해 플레이트를 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
   참고: 세포 생존가능성을 감소시키기 때문에 장기간(>10분) 동안 트립신 용액에 세포 노출을 피하십시오.
6. 플레이트에 예동이 있는 매체 1mL을 넣고, 부드럽게 파이펫 셀을 위아래로 사용하여 세포 덩어리를 분해합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮기고 3-5mL의 미디어를 추가합니다.
7. 세포 수를 측정하려면, 10 μL의 세포셀을 Trypan 블루의 10 μL로 혼합하고 10 μL을 혈류계로 옮기거나 다른 세포 계수 방법을 사용합니다.
8. 세포를 권장하는 세포 밀도로 희석하고 500 μL/잘 24웰 TC플레이트(표 1)에넣습니다. 내인성 아세서(PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 및 PRMT9)의 경우 3.1단계로 이동합니다.

2. 세포 질주

1. 외인성 소사(PRMT3, PRMT6, PRMT8)의 경우 권장량의 DNA(표 2)를 가진 HEK293T 세포입니다. HEK293T 세포는 트랜스펙트가 용이하므로 제조업체의 지시에 따라 모든 경질 시약을 사용할 수 있습니다.

3. 화합물 처리

참고: 배양 매체의 최종 디메틸 설산화물(DMSO) 농도가 0.1%를 초과하지 마십시오. 각 웰에 동일한 DMSO 농도를 유지합니다. 선택적 PRMT 억제제(화학 프로브) 및 밀접하게 관련된 비활성 유사체는 표 3에서발견될 수 있다.

1. 내인성 아약(PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 및 PRMT9)의 경우 세포에서 미디어를 제거하고 500 μL의 미디어를 화합물 또는 DMSO만으로 교체합니다(대조군).
   참고: R 메틸화 수치가 80% 이상 감소하는 것을 관찰하는 데 는 보통 2일이 걸립니다.
2. 외인성 아세약(PRMT3, PRMT6, PRMT8)의 경우, 트랜스펙트 후 미디어 4h를 제거하고, 화합물 또는 DMSO만으로 500 μL의 미디어를 추가하고(대조)하고, 20-24h에 대한 배양한다.

4. 세포 리자테 준비

1. 우물에서 모든 미디어를 제거하고, 잔류 매체를 제거하기 위해 PBS100 μL로 세척, 그리고 용해 버퍼 60 μL (20 m Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM 에틸렌디아마네트라 아세틱 산 (EDTA), 10 mM MgCl_2,0.5 % 트리톤 X-100, 12.5 U mL-1 벤조, 완성 EDA 의 용액 을 추가합니다.
   1. RT에서 1분 미만 동안 배양하여 플레이트를 흔들어 세포 에 용해 버퍼를 분배합니다. 그런 다음 20%의 3 μL을 20%의 1μL/v 나트륨 도데킬 황산염(SDS)에 넣고, 최종 1% 농도에 넣고 부드럽게 흔들어 섞는다. 리세이트를 미세 원심 분리튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 벤조나아제와 단백질 억제제 칵테일을 사용하기 전에 신선하게 추가하세요. 벤조나아제의 첨가는 세포 용해 점도를 감소시키는 핵산을 빠르게 가수분해합니다.
2. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 시료의 단백질 농도를 결정하거나 용액에서 1% SDS를 용인하는 다른 방법을 사용하십시오.
   1. 용액 및 단백질 표준(0, 1, 2, 4 및 8 μg/mL)을 96웰 클리어 플레이트의 우물에 넣습니다.
   2. 시약 A를 시약 B와 50:1 비율로 혼합하고 우물당 200 μL을 추가합니다. 37°C에서 20분 동안 배양하고 흡광도를 읽습니다.
3. 리시스 버퍼로 단백질 농도를 조정하여 시료 전체에 걸쳐 동일합니다.
4. 4x 로딩 버퍼20μL을 셀 용해 60μL에 넣고 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 열 성수 후, 용재는 -20 °C에 저장 될 수있다.

5. 웨스턴 블롯 분석

1. 히스톤 단백질을 분석하기 위해 총 세포 용액의 5-20 μg와 다른 단백질을 위한 20-100 μg를 4-12% 비스 트리스 단백질 젤로 적재한다.
2. 100V에서 약 2시간 동안 또는 염료 전면이 젤의 바닥에 도달할 때까지 MOPS SDS 러닝 버퍼(50mM MOPS, 50mM Tris Base, 0.1% SDS w/v, 1mM EDTA, pH 7.7)에서 젤을 실행한다.
3. 젖은 이송을 수행하는 경우, 얼음 차가운 트리스- 글리신 전달 버퍼 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20 % v / v 메탄올, 0.05 % w / v SDS)로 전송 샌드위치를 조립합니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 스폰지, 필터 용지, PVDF 멤브레인 및 젤을 놓습니다. 메탄올에 담그고 조립 전에 30s의 이송 버퍼에 젤을 계평화하여 PVDF 멤브레인을 활성화합니다.
      참고: 사용 권장 PVDF 서부 블로팅 멤브레인은히스톤(재료의 표)과같은 저분자 단백질에 대한 자가 형광 및 적합성이 낮기 때문에 사용하십시오.
4. 젤에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 70 V에서 얼음에 1.5h로 전달합니다.
5. 블로킹 버퍼에서 30분 동안 멤브레인을 차단합니다(인산염 완충식염, PBS에서 우유를 5% w/v). 세척 버퍼 (PBST : PBS에서 0.1 % v / v 트위엔 -20) 및 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 (PBST에서 5 % BSA)에서 1 차 항체와 함께 배양 (PBST에서 5 % BSA) 하룻밤 4 °C(표 3).
   참고: 더 긴 보관을 위해 BSA 용액을 여과 소독하고, 0.02%를 추가하여 아지드 나트륨 을 넣고 4°C로 유지하십시오.
6. PBST로 3 x 5 분 세척 막. 그런 다음 염소 안티 래빗 (IR800) 및 당나귀 안티 마우스 (IR680) 항체를 권장 차단 버퍼(재료 표, 표 3)로배양하고 PBST로 3 x 5 분 세척하십시오.
7. 800 및 700 nm에서 형광 서쪽 블롯 이미저에서 신호를 읽으십시오. 바람직하게는 높은 감도 및 동적 범위, 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지 포화에 도달 할 때 경고뿐만 아니라 동일한 샘플 밴드에서 두 형광 색상의 멀티 플렉싱과 단일 이미지에서 명확하게 강한 희미한 밴드를 이미징 할 수있는 계측기를 사용합니다.
8. 형광 서양 이미징에 적합한 소프트웨어를 사용하여 서양 얼룩 분석을 위한 대역 강도를 결정합니다.

결과

개별 PRMT의 세포 소의를 위한 서쪽 얼룩 결과의 예는 아래에 제시됩니다. 에세이 세부 정보도 표 4에요약되어 있습니다.

PRMT1 분석
PRMT1은^{세포(13)에서}히스톤 4 아르기닌 3 비대칭 디메틸화(H4R3me2a)의 주요 기여자이다. PRMT1 활동이 손실되면 글로벌 Rme1 및 Rme2s 수준이 크게^{증가합니다.} 도 1A 및 1B에도시된 바와 같이, 몇몇 항체는 Rme1, Rme2a, Rme2s 및 H4R3me2a의 글로벌 변화를 모니터링하기 위하여 이용될 수 있다. 글로벌 Rme2a 및 H4R3me2a 수준에서 현저한 감소및 Rme1 및 Rme2s의 증가는 PRMT1 녹다운 3일 후에 관찰될 수있다(그림 1A,B). 세포주는 기저 H4R3me2a 신호에서 다르므로 PRMT1 활성의 손실을 모니터링하기 위해, 높은 기저 메틸화 수준을 가진 MCF7과 같은 세포주를 사용할 수있다(도 1C). PRMT1 억제의 효과를 관찰하는 최적의 시간은 예를 들어, I형 PRMT 억제제 MS023^8을사용하여 치료시, 2일간(도1D,1E)이다. 더 긴 처리는 감소된 세포 생존 및 성장 결과.

PRMT3 분석
PRMT3 세포 분석의 경우, PRMT3 녹다운 또는 과발현시 서부 블롯에서 메틸화 변화가 검출될 수 있는 선택적 바이오마커 단백질은 없습니다. PRMT3는 시험관 외^14에서비대칭적으로 분개한 H4R3로 나타났지만, 마크는 주로 PRMT1에 의해 증착되고, 따라서 과발현 PRMT3를 가진 외인성 분석이 설계되었다. 시험관 내 연구 결과와 일치, 야생 형 PRMT3의 과발현하지만 그것의 촉매 돌연변이 (E338Q)는 H4R3me2a 수준의 증가로 이어졌다(그림 2A). HEK293T 세포는 이 마크의 낮은 기저 메틸화를 가지고 있기 때문에사용되었다(도 1C). 분석은 PRMT3 선택적 억제제 SGC707^7로더 검증되었으며, 이는 PRMT3 의존형 H4R3 비대칭 메틸화(도2B)를억제하였다.

PRMT4 분석
PRMT4 비대칭 으로 아르기닌 1064^15에서BAF155를 희석. BAF165-R1064me2a를 검출하는 항체가 시판되기 때문에, 세포내 PRMT4 활성은 R1064me2a 마크 레벨의 변화를 검출함으로써 서부 블롯에 의해 모니터링될 수 있다. PRMT4 선택적 억제제, TP-064^10을가진 PRMT4 단백질 또는 촉매 활성의 손실은 BAF165-R1064me2a수준(그림 3)의감소를 초래한다. 2 일 치료는 일반적으로 메틸화 신호의 대부분을 제거하기에 충분하다.

PRMT5 분석
PRMT5는 단백질 아르기닌 대칭 디메틸화의 대부분을 담당합니다. SmBB를 포함한 다양한 SMN 복합 단백질이 PRMT5^{기판(16)인}것으로 이전에 보고되었다. PRMT5 활성은 SmBB의 단백질의 대칭 아르기닌 디메틸화 또는 대칭 디메틸화의 글로벌 수준의 변화를 보고 모니터링될 수 있다. PRMT5의녹다운은 PRMT1, 3, 4, 6 및 7이 아닌 글로벌 Rme2s 수준(그림4A)의감소를 초래합니다. 대부분의 세포주에서, PRMT5 선택적 억제제 LLY-283¹¹ 및 GSK591을 가진 세포의 처리는 2-3 일 동안 SmBB'Rme2s 신호의 대부분을 억제하였다(도 4B). 대부분의 세포는 PRMT5 억제에 민감하며, 이는 장기간 억제제 노출로 세포 증식 및 세포 사멸의 감소를 초래합니다.

PRMT6 분석
PRMT6는 세포^17에서히스톤 H3 아르기닌 2 비대칭 디메틸화(H3R2me2a)의 주요 기여자인 것으로 보고되었다. HEK293T 세포에서, PRMT6 넉다운3일 동안 은 H3R2me2a 수준에서 현저한 감소를 관찰하기에 충분하지 않았다. 그러나, 야생형 PRMT6의 과발현은 촉매 돌연변이체(V86K/D88A)의 수준을 높여 H3R8me2a 및 H4R3me2a(그림5A)를증가시킨다. 선택적, 알로스터제 PRMT6 억제제 SGC6870^18,PRMT 타입 I 억제제 MS023^8,및 PRMT4/6 억제제 MS049⁹: 다른 효능과 선택성을 가진 PRMT6 활성을 억제하는 몇 가지 억제제가 있다. 이러한 모든 억제 PRMT6 종속 H3R2(도 5B),뿐만 아니라 H4R3 및 H3R8 비대칭 디메틸화 (데이터는 표시되지 않음).

PRMT7 분석
PRMT7 단백구는 HSP70의 구성 및 유도 가능한 형태 모두에서 아르기닌 469(각각 HSPA8 및 HSPA1/6)^12. HSP70-R469me1 수준을 검출하는 시판되는 항체는 없지만, 마크는 팬 모노메틸 항체로 검출될 수 있다. PRMT7 단백질또는 PRMT7 선택적 억제제, SGC3027^12를갖는 촉매 활성의 저해의 손실은 HSP70-R469me1(도6A,B)의감소된 수준을 초래한다. SGC3027은 세포 투과성 프로약물로, 세포에서 환원효소에 의해 PRMT7 선택적 억제제 SGC8158로 변환되므로 세포 효능은 세포주 간에 다를 수 있다. 여러 암 세포주 발현 유도 성 HSP70 동소 높은 수준에서, 메틸화는 핵 기원의 중첩 특이한 대역으로 인해 검출하기 어려울 수 있습니다(도 6C). 따라서, PRMT7 세포 분석의 경우, C2C12와 같은 대부분 HSPA8을 발현하는 세포주를 권장하거나, HSP70이 주로 세포질에서 국소화되기 때문에, 바람직한 세포선의 세포질 분획에서 HSP70-R469me1 수준을 결정한다.

PRMT8 분석
PRMT8은 조직 제한 식 패턴을 가진 유일한 PRMT입니다 - 주로 뇌^(19)에서표현된다. 80% 시퀀스 유사성을 공유하며 PRMT1^19와유사한 기판 선호도를 갖는다. 주로 N-종착에서 PRMT1과 다르며, 여기서 심근화는 혈장^막(20)과PRMT8의 연관성을 초래한다. PRMT8과 함께 RNA 결합 단백질^EWS(21)를메틸레이트한 것으로 보고되었다. PRMT8 활성은 비신경 세포주에서 낮고 EWS도 PRMT1에 의해 메틸화 될 수 있기 때문에 PRMT1 녹다운 세포에서 EWS와 함께 PMRT가 공동 과발현되는 분석이 개발되었습니다. PRMT1은 필수 유전자이기 때문에 세포 사멸의 장기 손실 결과, PRMT1이 PRMT8 분석에서 사용하기 전에 3 일 동안 쓰러지는 유도 시스템이 활용되었다(그림 7A). 와일드타입 PRMT8의 공동 발현은 촉매적으로 비활성 돌연변이(E185Q)가 아니라, EWS와 함께 EWS 비대칭 디메틸화(그림7B)의증가수준을 초래하였다. 몇몇 비대칭 dimethylarginine 항체는 시험되고 메틸화는 Asym25 항체로만 검출되었습니다. 분석은 PRMT 타입 I 선택적 화학 프로브, MS023^8로더욱 검증되었으며, 이는 외인성 EWS(도7B)의PRMT8 의존비대칭 디메틸화를 감소시켰다. MS023은 체외 내 에서 PRMT8을 억제하는 데 매우 강력하지만, 세포에서 높은 농도의 MS023은 메틸화^{억제(21)를}볼 필요가 있다.

PRMT9 분석
PRMT9는 아르기닌 508^22에서대칭적으로 Dimethylate SAP145를 나타내고 있었다. 불행히도, 어떤 상업적으로 이용 가능한 항체는 마크를 인식할 수 없습니다. PRMT9 분석의 경우 양안홍 박사(베크만 희망연구소)가 친절하게 선물한 항체가 사용되었다. 과발현되면, R508K 돌연변이 SAP145는 RMT9(도8A)에의해 메틸화되어 있지 않지만, R508K 돌연변이SAP145는 과발현한다. 분석은 내인성 SAP145-R508me2s의 수준을 모니터링하도록 설계되었으며 나노 몰름 효능으로 시험관내에서 PRMT9를 강력하게 억제하는 프로토타입 PRMT9 억제제(진행 중인 작업, 아직 발표되지 않음)인 화합물 X로 검증되었습니다. 화합물 X는 용량 의존방식으로 SAP145-R508me2s 수준을 감소시켰습니다(도8B).

그림 1. PRMT1 셀룰러 분석. (A) PRMT1 녹다운은 글로벌 비대칭 아르기닌 디메틸화(Rme2a)의 감소와 대칭 아르기닌 디메틸화(Rme2s) 및 단조량(Rme1)의 증가수준을 초래한다. PRMT1 녹다운 효율은 패널 B.(B)PRMT1 녹다운감소히의 히스톤 H4R3(H4R3me2a)의 비대칭 디메틸화를 감소시다. (C)기저 H4R3me2a 수준은 다른 세포주마다 다릅니다. (D)타입 I PRMT 억제제 MS023은 용량 의존적인 방식으로 H4R3me2a 수준을 감소시다. MCF7 세포는 2일 동안 MS023로 처리되었다. (E)그래프는 H4R3me2a 신호 강도의 비선형 적당성을 나타내며 총 히스톤 H4로 정규화된다. MS023 IC50 = 8.3 nM (n =1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. PRMT3 셀룰러 분석. (A)PRMT3의 E338Q 촉매 돌연변이는 HEK293T 세포에서 H4R3me2a 수준을 증가시키지 만, 야생형(WT)의 과발현을 증가시킨다. 세포는 24시간 동안 플래그 태그PRMT3로 전염되었다(B)PRMT3 선택적 억제제, SGC707, ectopic PRMT3 종속 H4R3 비대칭 디메틸화를 감소시키는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. PRMT4 셀룰러 분석. (A) PRMT4 녹다운은 BAF155-R1064 비대칭 아르기닌 디메틸화(HEK293T 세포)의 감소를 초래한다. (B)PRMT4 선택적 억제제, TP-064, BAF155-R1064Rme2a 수준이 감소한다. HEK293T 세포는 2일 동안 화합물로 처리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. PRMT5 셀룰러 분석. (A) PRMT5 녹다운은 글로벌 대칭 아르기닌 디메틸화 수준(MCF7 세포)의 감소를 초래한다. (B)PRMT5 선택적 억제제 GSK591 및 LLY-283, SmBB의 대칭 아르기닌 디메틸화(green)를 감소시키고, SmBB의 총 수준은 변하지 않고 있다(빨강). MCF7 세포는 2일 동안 화합물로 처리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. PRMT6 셀룰러 분석. (A)HK293T 세포에서 V86K/D88A 촉매 돌연변이 PRMT6의 과발현은 H4R3me2a, H3R2me2a 및 H3R8me2a 수준을 증가시키지 않는다. 세포는24시간(B)PRMT6 선택적 억제제(SGC6870), PRMT형 I 억제제(MS023), PRMT4/6 억제제(MS049) PRMT6 의존형 H3R2me2a 수준에 대해 플래그 태그PRMT6로 전염되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. PRMT7 셀룰러 분석. (A) PRMT7 녹아웃은 HSP70-R469 단메틸화(HCT116 세포)의 감소를 초래한다. (B)PRMT7 선택적 억제제, SGC3027, C2C12 세포에서 HSP70-R469 단조량 감소. 세포는 2 일 동안 화합물로 처리되었다. (C)팬 모노메틸 아르기닌 항체(Rme1)를 가진 유도 가능한 HSP70(HSPA1/6)의 HSP70-R469 메틸화 검출은 핵 기원의 중첩특이한 대역으로 인해 어려울 수 있다. 세포질 분획에서 HSP70 메틸화 수준을 측정하는 것이 좋습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7. PRMT8 셀룰러 분석. (A)EWS의 PRMT8 메틸화는 PRMT1 활성이 녹다운에 의해 억제될 때 검출될 수 있다. HEK293T 세포는 유도할 수 없는 PRMT1 녹다운 벡터로 변환되었다. 독시사이클린 치료 3일 후 PRMT1 수치가 대폭 감소했습니다. (B) PRMT1이 쓰러질 때, 외인성 EWS는 PRMT8의 과발현 된 야생 형 PRMT8하지만 촉매 돌연변이 (E185Q)에 의해 비대칭적으로 희석된다. 메틸화는 PRMT 타입 I 억제제(MS023)의 고농도에 의해 감소된다. HEK293T PRMT1KD 세포는 플래그 태그PRMT8 야생형 또는 촉매 돌연변이 및 GFP 태그 EWS와 공동 접전되어 20시간 동안 MS023으로 처리하였다.

그림 8. PRMT9 셀룰러 분석. (A)R508K 돌연변이 SAP145는 PRMT9에 의해 메틸화되지 는 않지만 야생 유형은 아닙니다. HEK293T 세포는 1일 동안 GFP 태그SAP145로 전염되었다. (B)프로토타입 PRMT9 억제제(Compound X)는 용량 의존형 방식으로 SAP145의 PRMT9 의존성 R508 대칭 디메틸화를 감소시다. HEK293T 세포는 2일 동안 화합물로 처리되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PRMT	셀	ml당 밀도
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*PRMT8 분석에 대한 도금 3 일 전에 독시 사이클린 (2 μg / mL)으로 세포를 치료

표 1. PRMT 에세이에 권장하는 세포 유형 및 밀도.

PRMT	μg DNA/24웰	애드진 #	추가 노트
PRMT3	0.5 플래그-PRMT3	164695
	또는 0.5 플래그-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 플래그-PRMT6	164697
	또는 0.5 플래그 PRMT6 (V86K/D88A)	164698
PRMT8	0.05 EWS-GFP	164701
	0.45 PRMT8-플래그	164699
	또는 0.45 PRMT8(E185Q)-플래그	164700
PRMT9	0.05 SAP145-GFP	NA	양안홍 박사의 선물, 베크만 희망의 도시 연구소
	또는 0.05 SAP145-R508K-GFP
	0.45 빈 벡터

표 2. 경질 실험에 권장되는 DNA 농도.

PRMT	항체	화학 프로브(세포 활성 IC50)	음수 제어
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT 타입 I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, 각각)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-액틴 (1:500)
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	플래그 (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	스키-73 (IC50 = 540 nM)*	스키-73N*
PRMT5	안티 SmBB '(1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0.9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT 타입 I	MS094
	H3R2me2a (1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, 각각)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM, 각각)	MS049N
	H3 (1:5000)
	플래그 (1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	플래그 (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s -친절한 선물 양 얀중 박사, 베크만 희망의 도시 연구소 (1:1000) (PIMID: 25737013)
이차 항체	염소 안티 토끼 IgG-IR800 (1:5000)
	당나귀 안티 마우스 IgG-IR680 (1:5000)
*- 항체는 HSPA8, HSPA1 및 HSPA6 (과발현 GFP 태그 단백질로 시험됨), *prodrug - IC50은 다양한 세포주 간에 다를 수 있습니다.

표 3. 권장 된 항체 및 PRMT 화학 프로브/음극식 공구 화합물.

PRMT

바이오마커

분석 판독

분석 유효성 검사

권장 셀라인

심판.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

H4R3me2a 수준은 B-actin으로 정규화된 총 H4 글로벌 Rme1, Rme2a 또는 Rme2s 수준으로 정규화되었습니다.

PRMT1의 녹다운은 기저 H4R3me2a 및 글로벌 Rme2a 수준을 감소시키고 세포에서 글로벌 Rme1 및 Rme2s 수준을 증가 (도.1A, B). PRMT 타입 I 화학 프로브 MS023은 용량 의존적 방식으로 H4R3me2a의 수준을 감소시켰습니다(도 1D).

세포는 기저 H4R3me2a 수준(도 1C)에서 다릅니다. MCF7 세포는 PRMT1 활동의 감소를 모니터링하는 것을 바람직하게 만드는 높은 기저 H4R3me2a 수준을 갖는다.

8

PRMT3

H4R3me2a

H4R3me2a 메틸화 수준은 외인성 플래그 태그 PRMT3 WT 또는 촉매 E338Q 돌연변이(배경)로 인한 메틸화 수준으로 총 히스톤 H4로 정규화됩니다.

야생형 PRMT3의 과발현은 촉매 돌연변이(E338Q)가 증가하여 H4R3me2a(도 2A)를 증가시켰습니다. PRMT3 선택적 억제제 SGC707 H4R3me2a 수준에서 PRMT3 의존증가 감소 (도 2B)

HEK293T 세포는 낮은 기저 H4R3me2a 수준 (도 1C)을 가지고 있으며, 이는 외인성 PRMT3 활성을 모니터링하는 것이 바람직합니다.

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

BAF155-R1064me2a 수준 총 BAF155로 정규화

PRMT4 넉다운은 BAF155의 비대칭 디메틸화를 감소시다(도 3A). PRMT4 선택적 화학 프로브(TP-064)를 사용한 2일 치료는 BAF155(도 3B)의 비대칭 디메틸화를 감소시켰다.

모든 세포주

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

팬 Rme2s 항체로 검출된 SmBB'-Rme2s 수준 (CST) 총 SmBB로 정규화

PRMT5의 녹다운은 SmBB의 대칭 디메틸화 수준이 감소했습니다(도 4A). PRMT5 선택적 화학 프로브, GSK591 및 LLY285로 2 일 치료, SmBB'-Rme2s 수준 감소 (도 4B).

모든 세포주

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

H4R3me2a, H3R2me2a 또는 H3R8me2a 메틸화 수준은 외인성 플래그 태그 PRMT6 WT에 의해 증가하지만 촉매 V86K, D88A 돌연변이(배경)는 각각 총 히스톤 H4 또는 H3로 정규화됩니다.

야생형 PRMT6의 과발식은 촉매 돌연변이체(V86K,D88A)가 H3R2me2a, H3R8me2a 및 H4R3me2a 수준(도 5A)을 증가시켰습니다. 알로스터PRMT6 억제제(SGC6870), PRMT 타입 I 억제제 MS023, PRMT4/6 억제제 MS049는 H3R2me2a 수준에서 PRMT6 의존증가(도 5B)를 감소시다.

HEK293T 세포는 기저 H4R3me2a, H3R2me2a 및 H3R8me2a 수준을 가지며, 이는 외인성 PRMT6 활성을 모니터링하는 것이 바람직합니다.

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

HSP70-Rme1 메틸화 수준은 총 HSP70으로 정규화

PRMT7 녹아웃 또는 넉다운감소 HSP70 단조량(도 6A). PRMT7 선택적 화학 프로브 SGC3027을 갖는 2일 치료는 용량 의존형 방식으로 PRMT7 종속 HSP70 단조량 감소(도 6B).

C2C12, HT180 몇몇 암 세포주는 메틸화 신호가 핵 기원의 특이하지 않은 단백질과 겹치는 HSP70의 유도성 형태를 표현합니다 (도 6C). 이 경우 세포질 분획에서 HSP70 메틸화 수준을 분석하는 것이 좋습니다.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

외인성 GFP 태그 EWS 메틸화 수준은 외인성 플래그 태그PRMT8 WT 또는 E185Q 촉매 돌연변이(background)로 인한 것으로, PRMT1 KO 세포에서 총 GFP 신호로 정규화되었다.

중형 PRMT8의 과발현은 촉매 E185Q 돌연변이 메틸화 자궁 EWS를 PRMT1 KD 세포에서만 이시형으로 표현한다(도 7A). PRMT 타입 I 화학 프로브 MS023은 PRMT8(도 8B)에 의한 외인성 EWS의 비대칭 디메틸화를 억제하였다.

HEK293T PRMT1 KD (유도 가능). PRMT1 녹다운 은 세포 사멸을 초래하므로 유도 할 수없는 시스템을 사용하는 것이 좋습니다.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

PrMT9 종속 SAP145 대칭 디메틸화 R508에서 SAP145로 정규화

손실 PRMT9하지만 PRMT5는 SAP145의 감소 대칭 디메틸화로 이어질 수 있습니다. GFP 태그 SAP145 WT하지만 SAP145mut (R508K)는 PRMT9 (도 8A)에 의해 메틸화되었다. 코파운드 X를 가진 2 일 처리, 프로토 타입 PRMT9 억제제, 용량 의존적인 방식으로 SAP145-R508me2s 수준을 감소 하였다 8B).

모든 세포주

21

표 4. PRMT 어세이스 요약.

토론

여기서, PRMT 제품군의 구성원을 위한 상세한 세포 분석 프로토콜은 형광 서쪽 블로팅 방법을 사용하는 것으로 기술된다. 아르기닌 메틸화의 변화가 개별 PRMT 손실 또는 촉매 억제에 따라 쉽게 검출될 수 있고 다른 가족 구성원에 의해 보상될 수 없는 독특한 기판이 선택되었다. 일부 단백질은 다중 PRMTs(21,^23)에의해 메틸화되며, 일부 PRMT가 주어진 단백질 기판^{24,25,26,27에서}소량의 세포 마크만 기여하는 기판 특이성에 중첩을 제안하며, 예를 들어 PRMT8과 PRMT1모두 EWS의 메틸화에 기여한다. 따라서, 각 분석은 녹다운 및/또는 과발현 실험을 통해 기판 및 항체의 철저한 검증을 요구하고 잘 특징적인 선택적 억제제를 통해 추가 검증을 요구했다. PRMT 특이기는 메틸-아르기닌 마크 수준에 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 감소된 세포 생존력 및 증식의 복합 효과를 피하기 위해 PRMT 손실/억제 후 2-3일 이내에 메틸화 마크 변화를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. PRMT1, 4, 5, 7 및 9에 대한 고유 기판을 찾을 수 있었지만; PRMT3, 6, 8의 경우 기능 접근 방식을 채택해야 했습니다. 몇몇 아르기닌 메틸 특이적 항체는 각종 세포 표적을 위해 시험되었습니다, 그러나 PRMT3 및 PRMT6 녹다운의 3 일 안에 중요한 변경을 검출할 수 없었습니다; 따라서, 바이오마커 어약은 촉매비활성 돌연변이체와 함께 ectopically 발현된 효소를 사용하여 개발되었으며, 이는 기준기질 메틸화에 대한 대조군역할을 하였다. PRMT8은 가까운 PRMT1 동형 론이며 유사한 기판 기본 설정을 공유합니다. PRMT8 선택적 바이오마커를 식별할 수 없기 때문에 PRMT1 녹다운 세포의 분석이 개발되었으며, PRMT8은 EWS와 함께 공동 발현되었다. PRMT1은 또한 H4R3 비대칭 메틸화에 대한 주요 효소이므로, PrMT3 및 PRMT6 세포 분석제의 바이오마커로서 H4R3me2a를 사용하는 주요 효소이며, 기저 H4R3me2a 수준이 낮은 세포를 촉매 활성 돌연변이뿐만 아니라 촉매 활성 돌연변이체로 선택하였다. 내인성 소제가 선호되지만, 외인성 소는 몇몇 선택적PRMT^{억제제7,8,9의}세포 효능을 시험하는 데 매우 귀중한 것으로 판명된다. PRMT 생물학에 대한 지식이 증가함에 따라 PRMT3, PRMT6 및 PRMT8에 대한 보다 구체적인 바이오마커 단백질을 찾아서 분해를 개선할 것으로 기대합니다.

검증된 항체및 적당한 통제의 사용은 PRMT 분석 성능에 중요합니다. 여기에 권장되는 모든 항체는 녹다운 및 과발현 실험에 의해 철저히 검증되었지만, 특히 다발성 항체의 경우 배치 대 배치 차이는 여전히 성능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 분석 신뢰성을 확인하기 위해 밀접하게 관련된 부정적인 제어와 함께 유전 방법 및 화학 프로브를 사용하는 것이 중요합니다. 또한 단백질 과발현이 필요한 PRMT 아세약의 경우, 야생형 단백질과 함께 촉매활성 돌연변이를 사용하여 기저 메틸화 수준을 결정하는 것이 중요합니다.

세포내 PRMT의 활성을 프로파일링하기 위한 정량적 분석의 이 수집은 기본적인 세포 배양 및 형광 서부 블로팅 기술만을 포함하는 최소한의 장비및 제한된 기술 적 전문 지식으로 신속하고 쉽게 구현될 수 있기 때문에 과학 계에 광범위하게 유용할 수 있습니다. PRMT에 대한 권장 항체 및 화학 프로브는 또한 주어진 ABPP 프로브의 적합성을 확립하고, 표적 참여를 모니터링하고, 경쟁ABPP 형식을 사용하여 오프 타겟 효과를 평가하기 위해 활성 기반 단백질 프로파일링(ABPP) 분석을 위해 사용될 수 있다. 여기에서 논의된 분석 발달 접근은 또한 단백질 lysine-메틸 전달효소 및 아세틸 전달효소와 같은 그밖 효소 가족을 위해 추정될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm TC 접시	Greiner bio-one	664160
24-well TC 플레이트	Greiner bio-one	662160
4– 12% Bis-Tris 단백질 겔	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF 멤브레인	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
안티 BAF155	산타 크루즈 생명 공학	sc-32763
안티 BAF155-R1064me2a	밀리포어 시그마	ABE1339
안티 플래그 (#, 1:5000)	밀리포어 시그마	F4799
안티 GFP	클론텍	632381
안티 H3	Abcam	ab10799
안티 H3R2me2a	밀리포어 시그마	04-848
안티-H3R8me2a	록랜드	600-401-I67
안티-H4	Abcam	ab174628
안티-H4R3me2a	액티브 모티프	39705
안티-Hsp/Hsc70	엔조	ADI-SPA-820
안티-PRMT1	밀리포어-시그마	07-404
안티-PRMT3	Abcam	ab191562
anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anti-PRMT5	Abcam	ab109451
anti-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7	Abcam	, ab179822
anti-Rme1	CST	, 8015
anti-Rme2a,	CST,	13522
anti-Rme2s,	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			City of Hope Beckman Research Institute of City of
Hope anti-SmBB'	산타 크루즈 생명 과학	sc-130670
벤조 나제			생산 사내
BSA	Millipore - 시그마	A7906
C2C12			선물 박사 스테판 리처드, 맥길 대학
cOmplete, EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일	Millipore - 시그마	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
당나귀 안티 마우스 IgG-IR680	Licor	926-68072
독시사이클린	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
글리신	Bioshop	GLN002.5
염소-안티-토끼 IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			York University
Image Studio 소프트웨어 ver 5.2	Licor
로딩 버퍼: NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22&무역;
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey 차단 버퍼 (PBST로 4배 희석)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) 차단 버퍼도 사용할 수 있습니다 # 927-70001
Odyssey CLX 이미징 시스템	Licor	모델 번호 9140
PBS (조직 배양)	Wisent	311-010-CL
PBS (웨스턴 블롯)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
피어스&트레이드; BCA 단백질 분석 키트	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
탈지 분유	Bioshop	SKI400.500
TC20 자동 세포 계수기	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
트리빵 블루	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500