이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.
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방법 논문
폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성
이 논문에서
요약
초록
인간 폐 발달 및 질병은 생물학적으로 관련된 체외 모델 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 어려웠습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 상피 및 중간 엽 세포 집단으로 만든 3D 다세포 폐 오르가노이드로 단계적으로 분화 될 수 있습니다. 우리는 다양한 성장 인자와 작은 분자를 효율적으로 생성하여 배아 발달 신호를 재구성하여 최종 엔도름, 전방 전방 전구 장부, 그리고 그 이후에 폐 선조 세포를 생성합니다. 이 세포는 그 때 감소된 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 매트릭스 매체에 내장되어, 그(것)들이 외부 성장 인자에 응하여 3D 폐 오르가노이드로 자발적으로 발전할 수 있게 합니다. 이 전체 폐 오르가노이드 (WLO)는 덱사메타손, 순환 앰프 및 이소부틸산틴에 노출 된 후 형성 형성 및 성숙을 포함한 초기 폐 발달 단계를 겪습니다. WlOs는 마커 KRT5 (기저), SCGB3A2 (클럽) 및 MUC5AC (잔)뿐만 아니라 HOPX (alveolar 타입 I) 및 SP-C (alveolar type II)를 표현하는 폐포 상피 세포를 발현하는 기도 상피 세포를 보유하고 있습니다. 중간엽 세포는 또한 평활근 액틴(SMA) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα)를 포함하는 존재한다. iPSC 유래 WlOs는 몇 달 동안 3D 배양 조건에서 유지될 수 있으며 특정 세포 집단을 정화하기 위해 표면 마커를 위해 정렬될 수 있다. iPSC 유래 WlOs는 또한 폐 상피와 관혈 사이의 신호를 포함하여 인간의 폐 발달을 연구하고, 인간 폐 세포 기능 및 발달에 대한 유전 적 돌연변이를 모델링하고, 감염제의 세포 독성을 결정하는 데 활용될 수 있다.
서론
폐는 배아, 의사, 캐날리큘러, 충류, 및 미세 혈관 성숙1,2 - 6 개의 별개의 단계에서 발전하는 복잡하고 이질적이며 역동적 인 기관입니다. 후자의 두 단계는 조산이 발생하지 않는 한 태아 발달 중에 독점적으로 발생하는 반면, 인간 발달에서 산후적으로 발생합니다3. 배아 단계는 내피 세균 층에서 시작하여 기관및 폐 싹의 신진으로 끝납니다. 폐 발달은 상피 세포와 중간엽 세포 4 사이의 신호를 통해 부분적으로 발생합니다. 이러한 상호 작용은 폐 분지, 증식, 세포 운명 결정 및 발전 폐의 세포 분화를 초래합니다. 폐는 전도 영역(말기 기관으로의 기관) 및 호흡기 영역(폐포에 대한 호흡기 기관지)으로 나뉩니다. 각 영역은 독특한 상피 세포 유형을 포함; 기저, 분비, 모양, 브러시, 신경 내분비 및 이오노세포 세포를 실시하는 기도55, 호흡 상피에서 폐포형 I 및 II 세포가 뒤따른다. 많은 개발 및 다양 한 세포 유형의 부상에 대 한 응답에 대 한 아직 알 수 없습니다. iPSC 유래 폐 오르가노이드 모델은 인간의 폐....
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프로토콜
이 연구 프로토콜은 UCSD의 인간 연구 보호 프로그램 (181180)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 유도 만능 줄기 세포에서 최종 엔도드름 유도 (1 일 - 3)
- 천천히 해동 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 (BM) 매트릭스 배지 얼음에 30 분 전에 사용하기 전에. 감기 DMEM/F12에서, 혼합물은, GFR BM 매트릭스 배지를 희석시켜 이 매체의 50%를 구성한다. P1000 파이펫 팁을 냉동실에 놓아 사용하기 전에 식힙니다.
- 얼음 차가운 DMEM/F12로 제조된 500 μL의 500 μL의 500 μL로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅합니다. 원하는 수의 우물이 코팅되면, 우물에서 여분의 중간 혼합물 및 /또는 거품을 제거하고 20 분 동안 얼음이나 냉장고에 접시를 놓습니다. 그런 다음, 접시를 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이터로 이동하여 겔화하고 건조시합니다.
- hiPSC가 70-90%의 연결성에 도달하면 해리 전에 10 μM의 Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y-27632를 추가합니다. 매체를 흡기하고 인산염 완충식식염(PBS)으로 한 번 씻으세요. 세포 분리 배지(0.5mL/12웰 플레이트의 우물)를 첨가하여 hiPSC를 해리하고 5% C....
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결과
도금 후 24시간, 1일째, iPSC는 50%-90%의 컨할 수 있어야 합니다. 2일째에 DE는 90%-95%로 응모해야 합니다. DE 유도 하는 동안, 그것은 일반적인 세포 죽음을 관찰 하는 4 4 하지만 부착 된 세포는 소형 조약 돌 형태를 유지 합니다 (도 2b). 대부분의 부착 세포가 분리되고 활성 A를 사용하여 DE 미디어에 대한 노출을 6-12 h로 단축하는 것을 고려하는 경우 분화를 중단합니다. AFE 유도 하는 동안, 세포 죽음은 최소한의, 그리고 세포는 준수 남아, 하지만 더 작고 더 이질적 나타납니다. 7일째에 세포를 전달하는 것은 이중 양성 SOX2와 FOXA2의 수율이 >80%인 경우에만 이루어져야 합니다. 3D LPC 유도를 위한 지하 막 매트릭스로 전달한 후, 작은 스페로이드가 먼저 나타나고, 성장하고 일부는 분기를 시작할 수 있습니다. 성공적인 내피 분화를 위한 유전자 발현 프로파일은 SOX2 및 FOXA2의 존재와 함께 SOX17 증가, FO.......
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토론
3D 전체 폐 오르가노이드 (WLO)의 성공적인 분화는 성장 인자와 소분자에 노출되는 시간, 패세후 세포 밀도 및 hiPSC의 품질을 포함하여 세부 사항에주의를 기울여 다단계 6 주 프로토콜에 의존합니다. 문제 해결의 경우 표 2를 참조하십시오. hiPSC는 약 70%-80%의 컨할 수 있어야 하며, 해리 전에 5% 미만의 자발적인 분화를 해야 합니다. 이 프로토콜은 "mTeSR 플러스"매체를 요구합니다. 그러나, 일반 "mTeSR" 매체는 또한 비교 결과사용 하 고 저렴 한. 세포 외 매트릭스의 경우, 우리는 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 사용합니다. 우리는 차별화를 줄이기 위해 ReLesR ( 재료의 표 참조)를 사용하여 hiPSC를 통과합니다.
엔도름 분화 중에 세포는 미디어 변경 전과 후에 매일 시각화되어야 합니다. 지정된 성장 인자/소분자는 조기 분해를 방지하기 위해 베이스 배지에 매일 신선하게 첨가해야 합니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에 의해 지원 되었다 (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12웰 인서트, 0.4um, 반투명 | VWR | 10769-208 | |
| 2-메르토에탄올 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| 아스코르브산 | Sigma | A4544 | |
| B27 | ThermoFisher | 12587010 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V, 7.5% 용액 | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life 햄 | 35050061 | |
| s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove' s 수정된 둘베코' s 매체 (IMDM) + 글루타맥스 | 인비트로젠 | 31980030 | |
| 녹아웃 세럼 대체품 (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| 모노티오글리세롤 | 시그마 | M6145 | |
| mTeSR 플러스 키트 (10/케이스) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 펜/연쇄상구균 | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | 줄기세포 기술 | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R& D 시스템 | 1254/1 | |
| <강한>성장 인자/소분자 | |||
| 액티브 A | R& D 시스템 | 338-AC | |
| 올 트랜스 레티노산(RA) | 시그마-알드리치 | R2625 | |
| BMP4 | R& D 시스템 | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | 시그마-알드리치 | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 | D4902 | |
| 도르소모르핀 | R& D 시스템 | 3093 | |
| EGF | R& D 시스템 | 236-EG | |
| FGF10 | R& D 시스템 | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R& D 시스템 | 251-KG/CF | |
| IBMX(3-이소브틸-1-메틸크산틴) | 시그마-알드리치 | I5879 | |
| SB431542 | R& D 시스템 | 1614 | |
| VEGF / PIGF | R & D 시스템 | 297-VP/CF | |
| 1차 항체 | 희석 속도 | ||
| CXCR4-PE | R& D 시스템 | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-398703 | 0.18055556 |
| HTII-280 | 테라스 생명 공학 | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R& D 시스템 | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (성숙) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (성숙) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
참고문헌
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M.
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