여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
메가카요세포의 분화 및 성숙은 골수의 세포 및 세포 외 구성 요소와 밀접한 관련이 있습니다. 이러한 공정은 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 거대 카르요세포 세포질에서 필수 구조의 점진적인 출현, 경계막 시스템(DMS) 및 순환 혈소판에서 발견되는 조밀하고 알파 과립이라고 불리는 내부 멤브레인 네트워크인 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 필수 구조의 점진적인 외관을 특징으로 합니다. 본 기사에서는, 우리는 골수의 성숙 단계와 세포 밀도를 정의하는 주요 특성의 식별을 허용하는 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)을 사용하여 뮤린 거대 카르요세포의 시투 초구조 적 연구를위한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 뼈 로는 플러시, 고정, 에탄올탈수, 플라스틱 수지에 내장, 횡단면을 생성하기 위해 장착된다. 반박형 및 얇은 단면은 각각 조직학 및 TEM 관측을 위해 준비됩니다. 이 방법은 모든 EM 시설에서 모든 골수 세포에 사용할 수 있으며 동일한 마우스에서 여러 이미징 접근법의 조합을 허용하는 작은 샘플 크기를 사용하는 장점이 있습니다.
서론
메가카요세포는 골수에 국한되어 혈소판 생산1을담당하는 대형 폴리플로이드 세포를 특수화한다. 그(것)들은 복잡한 성숙 과정을 통해 조혈 줄기 세포에서 유래하고, 그 동안 거대 karyocyte 전구체가 점진적으로 크기가 증가하는 동안, 세포질과 핵2에있는 광대한 수반성 형태 변경을 겪고 있는 동안. 성숙 하는 동안, 메가 karyocytes 포함 하 여 구별 할 수 있는 구조 요소의 수를 개발: 폴리로부이트 핵, 경계 막 시스템을 형성 하는 표면 막의 질 (DMS), 액틴 기반 사이토스켈레탈 네트워크에 의해 둘러싸인 세포기관이 없는 주변 영역, α-과립, 고밀도 과립, 굴절을 포함 하 여 수많은 세포기관. 초구조적 수준에서, 관찰된 주요 수정은 DMS3에의해 분리된 이산 영역으로 세포질 구획화이다. 멤브레인의이 광범위한 공급은 혈소판 생산의 초기 단계에서 긴 세포질 공정의 확장을 연료, 다음 순환 내부 혈소판으로 리모델링됩니다. 메가카요세포 분화 및 성숙 중 모든 결함은 혈소판 수 및/또는 혈소판 기능의 기간 동안 혈소판 생산에 영향을 미칠 수 있습니다.
얇은 층 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)은 혈전 포에이시스....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 그림 1에괄호로 표시됩니다.
1. 골수 수집 및 고정 (그림 1A)
주의: 이 절차는 발암성, 돌연변이 및/또는 독성 물질을 포함하며 화학 추출 후드에서 수행됩니다. 장갑및 보호 안경과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
- 캘코디레이트 버퍼에서 2.5% 글루타랄데히드로 구성된 고정 솔루션을 준비합니다(보충 파일참조).
- 골수 컬렉션
- 성인 C57BL/6 생쥐를 성관계 12-18주 중으로 사용하십시오. CO2 질식 및 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시.
- 얇은 가위 한 켤레로 허벅지 주위의 피부를 자르고 핀셋을 사용하여 피부를 벗겨냅니다. 발의 사지를 제거한 다음 엉덩이와 허벅지 사이를 잘라냅니다. 무릎 관절에서 절단하여 대퇴골에서 경골을 분....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
골수 히스토로지
가벼운 현미경하에서 골수 톨루이딘 청색 조직학을 관찰하는 것은 조직 압축성, 미세혈관 연속성, 메가카르요세포의 크기 및 형상(도 1D)과 같은 관점에서 전체 조직 아키텍처를 빠르게 분석하는 열쇠이다. 그것은 골수 블록에서 더 깊은 절단의 필요성을 결정하기 위해 초박형 섹션 전에 수행됩니다. 거대한 크기와 핵 로빙으로 인해 더 성숙한 메가카요세포는 40배의 목표로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이것은 조직에 있는 성숙한 megakaryocytes의 조밀도 및 마이크로 혈관에 그들의 상대적인 현지화의 우수하고 빠른 개요를 제공합니다. 메가카요세포 증식 및 성숙의 이상은 이미 반박한 섹션에서 검출될 수 있었다.
골수 울트라 구조
뚜렷한 초구조적 특성에 기초하여, 뮤린 메가카요세포는 성숙의 순차적 단계를 나타내는 4단계.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
그들의 토착 환경에서 메가 카요 세포의 직접 검사는 메가 karyopoiesis 및 혈소판 형성을 이해하는 데 필수적이다. 본 원고에서, 우리는 골수 홍조와 침수에 의한 고정을 결합한 투과 전자 현미경 법을 제공하여 골수에서 일어나는 메가 카요세포 형태 발생의 전체 과정의 형태 학적 특성을 시상할 수 있도록 합니다.
골수의 플러싱은 고품질 플러싱의 성공은 작업자의 연습과 교육에 따라 달라지므로 이 방법의 중요한 단계입니다. 비록 섬세하지만, 골수를 플러시하는 것은 일반적으로 거대 카르요세포 형태에 중요한 유물과 관련된 완전한 탈석화를 위해 2 주 EDTA 치료를 필요로하는 미네랄 화 뼈의 제거를 피하는 가장 좋은 방법입니다. 추가적으로, 경골과 대퇴골에서 전체 고정되지 않은 뼈 marrows를 수집하는 주요 이점은 동일한 마우스에 여러 이미징 접근 방식을 결합하는 기능입니다. 실제로, 초구조 연구에는 단일 골수만 필요하며, 다른 세 가지 표본은 상호 보완적인 분석.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 선언할 이해 관계의 충돌이 없습니다.
감사의 글
저자들은 파비엔 프로머, 장 이브 린켈, 데이비드 호프만, 모니크 프룬드에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)을 통해 유럽 연합과 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01H.d.S.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, 미국 | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, 미국 | 1670-B | |
| CaCl2 염화칼슘 육수화물 | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, 미국 | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, | France 20821296 | |
| Filter 종이, 직경 90mm | Whatman, 영국 | 512-0326 | |
| 플랫 임베딩 실리콘 몰드 | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| 글루타르알데히드 25% | 전자 현미경 Sciences-EMS, 미국 | 16210 | |
| 열판 Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, 오스트리아 | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, 스위스 | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM 현미경 | JEOL, 일본 | EM-21001BU | |
| 구연산납 - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 염화마그네슘 육수화물 | Sigma, France | M2393-100g | |
| 장착 매체 - 폴리(부틸 메타크릴레이트-코메틸 메타크릴레이트) | 전자 현미경 과학-EMS, 미국 | 15320 | |
| 나딕 메틸 무수물(NMA) | Ladd Research Industries, 미국 | 21350 | |
| 오스뮴 테트록사이드 2% | Merck, 독일 | 19172 | |
| 프로필렌 옥사이드(1.2-에폭시프로판) | 시그마, 프랑스 | 82320-250ML | |
| 식염수 주사 용액 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| 메스 수술용 강철 블레이드 | Swann-Morton, | England.0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| 주사기 필터 0.2µ m | Pall Corporation, 미국 | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, 미국 | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, 오스트리아 | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, 오스트리아 | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, 미국 | 23620 |
참고문헌
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
