이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
골수 메가카요세포는 혈액 혈소판의 생산을 보장하는 큰 폴리플로이드 세포입니다. 그(것)들은 거대 karyopoiesis를 통해 조혈 줄기 세포에서 생겨나. 이 과정의 최종 단계는 복잡하고 고전적으로 이중성 메가카요세포-에리스로세포 전구체(MEP)와 단능한 메가카요시테 전조자(MKp)를 포함한다. 이 인구는 선의의 거대 카르요세포의 형성을 선행하고, 그 격리와 특성화는 거대 카르요세포 형성의 강력하고 편견없는 분석을 허용할 수 있었다. 이 프로토콜은 마우스 골수에서 조혈 세포를 수집하는 절차를 자세히 제시, 자기 고갈을 통해 조혈 선조의 농축과 마지막으로 매우 정제 MEP와 MKp 인구를 산출 세포 선별 전략. 첫째, 골수 세포는 대퇴골, 경골 및 또한 일강 문장, 조혈 선조의 높은 수를 포함하는 뼈에서 집합된다. iliac 문장 뼈의 사용은 마우스 당 얻은 총 세포 수를 크게 증가시키고 따라서 동물의 더 윤리적 사용에 기여한다. 450nm 자성 구슬을 사용하여 자기 계보 고갈을 최적화하여 유동 세포측정에 의한 매우 효율적인 세포 선별을 가능하게 했습니다. 마지막으로, 프로토콜은 두 개의 고도로 정제 된 메가 카요 세포 선조 모집단의 정렬을위한 라벨링 및 게이팅 전략을 제시합니다 : MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16 / CD9 dim ) 및 MKp (Lin- Sca-1-c 키트+CD16 + CD16 +CD16 + CD16 - CD16 - CD16 - CD16 - CD16 - CD16 + CD16 + CD16 + CD10 + CD10 + CD9dim)및 CD16 + CD16 + CD16 + CD16+CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD16 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10+ ). 이 기술은 구현하기 쉽고 i) 그들의 정체성과 생물학의 깊은 지식에 대한 분자 특성화를 수행하기에 충분한 세포 물질을 제공합니다, ii) 체외 분화 소사, 그 메가 카르요세포의 성숙의 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 것입니다, 또는 iii) 자신의 마이크로 환경과의 상호 작용의 체외 모델.
서론
혈액 혈소판은 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 이러한 큰 폴리플로이드 세포는 골수에 위치하며 모든 혈액 세포는 혈액 세포(HSC)1에서유래된다. 골수에 있는 거대 카르요세포의 생산의 고전적인 통로는 HSC에서 유래하고 점진적으로 그들의 분화 잠재력을 제한하는 다른 선조의 생성을 관련시킵니다2. 메가카요시틱 혈통에 대한 헌신에 서명한 첫 번째 선조는 에리스로이드 세포와 메가카요세포3,4,5를모두 생산할 수 있는 양성선조인 메가카르요세포-에리스로세포 전구(MEP)이다. 그런 다음 MEP는 혈소판을 생산할 수 있는 성숙한 메가카요시테로 분화하는 단능한 전구체/전구체(MKp)를 생성합니다. 이 선조의 생성에 관련되었던 기계장치는, megakaryocytes로의 그들의 분화 및 성숙 뿐 아니라 복잡하고 부분적으로만 이해됩니다. 추가적으로, 이러한 세포의 분화 잠재력과 본질적인 약정 수준의 관점에서 MEP 인구의 이질성은 여전히 불분명하다. 이러한 프로세스를 해독하기 위해서는 미세 분자 및 단일 세포 분석을 위해 MEP 및 MKp의 정제 된 인구를 ....
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프로토콜
동물관련 프로토콜은 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회에 따라 수행되었습니다(코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에르 데티크 앙 마티에르 데프레시먼트 애니멀 스트라스부르. 허가 번호: E67-482-10).
1. 마우스 뼈 컬렉션
- 제도적 지침에 따라 동물을 희생하십시오.
참고: 이 원고에 제시된 데이터는 8 주에서 12주 전에 C57Bl/6 마우스로부터 얻어졌습니다. 얻어진 세포의 수와 인용된 집단의 빈도는 나이와 마우스 변형에 따라 다를 수 있다. - 몸에 70% 에탄올을 뿌림합니다.
- 가위를 사용하여 척추에 수직으로 피부를 0.5-1cm 절개를 하고 몸 전체의 피부를 찢어버린다. 하체에서 피부를 당기고 피부를 제거합니다.
- 동물을 해부 패드에 놓고 아래로 향합니다. 노출된 척추를 따라 손가락을 위에서 아래로 밀어골반 뼈를 찾습니다. iliac 문장을 찾으려면 뒷다리 근처의 요추 부위의 작은 범프 (골반 뼈의 전방 우페리어 지역)를 식별하십시오. 도 1A,B는 마우스 해부학의 회로도 표현을 제시한다.
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결과
MEP 및 MKp로 확인된 세포의 Phenotypic 분석은 유동 세포측정에 의해 수행되었다. 세포는 형광 컨쥬게이징 항체로 CD41a 및 CD42c, 메가카요시틱 및 혈소판 계보의 고전적인 마커로 표지되었다. 두 마커모두 MKp 집단의 세포에 의해 발현되었으며, 이들 마커는 아직 MEP 집단의 세포의 표면에서 검출되지않았다(도 4Ai,4Aii). 폴리플로이디는 메가카요사이클의 특징입니다. 선별된 집단의 DNA 함량도 MEP 집단에 대해 주로 2N이고 MKp 세포의 작은 비율이 4N이지만, 이들 집단에서 더 높은 계략이 현저히 검출되지 않는다는 것을 입증하였다(도4Aiii).
선별된 세포 집단의 신원을 확인하기 위해, 여러 분화 분석이 메가카요시틱 및 적혈구 혈통을 구별하는 능력을 평가하기 위해 수행되었다. 첫째, 반고체 클로노제닉 분석체는 거.......
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토론
이 논문에 설명된 방법은 마우스 MEP 및 MKp의 추출 및 정제를 허용합니다. 프로토콜의 최적화에 있는 중요한 매개 변수는 대부분의 분자 및 세포 기지를 둔 분석과 호환될 세포의 충분한 수를 얻는 것이었습니다. 조혈 세포 추출을 위한 마우스 뼈 수집의 일반적인 사례는 일반적으로 각 마우스의 대퇴골과 티바이어스를 모두 수확하는 것으로 구성됩니다. 골반 뼈, 조혈 물질의 또 다른 소스, 따라서 종종 간과. iliac 문장을 수집하지 않는 이유는 마우스 골격의 내부 해부학에 대한 가난한 지식과 사용자가 대퇴골 머리 바로 위에 절단하여 뒷다리를 고전적으로 수집하고 있다는 사실입니다. 또한, 골수 세포가 경골과 대퇴골의 중앙 부분에 없는 trabeculae의 존재로 인해 효율적으로 일악 문장 뼈에서 플러시되지 않을 것이라고 가정합니다. 이 프로토콜에서, 이 두 가지 관심사는 해결되고 골반 뼈를 포함하여 각 힌드림 뼈의 적절한 홍조를 허용하는 표준화되고 신뢰할 수 있고 시간 효과적인 방법이 제시됩니다. 특히, 일강골의 사용은 마우스당 1.......
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공개 사항
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 모니크 프룬드, 캐서린 지셀, 케티에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)에 의해 지원되었으며 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01에서 Henri.de 라에 의해 지원되었습니다. 솔.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 21게이지 바늘 | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| 항체 Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | 자기 고갈 |
| 항체 B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | 자기 고갈 |
| 항체 Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | 자기 depletion |
| 항체 CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| 항체 CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| 항체 CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| 항체 CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| 항체 TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | 자기소모 |
| CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | 자기 |
| CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | 세포선별 |
| CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | 세포선별 |
| TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | 세포 분류 |
| 항체 CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | 세포 분류 |
| 항체 CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | 세포 분류 |
| 항체 CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | 세포 분류 |
| 항체 c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | 세포 분류 |
| 항체 Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | 세포 분류 |
| 항체 CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | 세포 분류 |
| 항체 CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | 세포 분류 |
| 배양 배지 StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| 해부 패드 | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| 에탄올 | vWR 화학 물질 | 83813.360 | |
| 집게 | Euronexia | P-120-AS | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Dutscher | 42011 | |
| 자석 : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| 마그네틱 비드: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| 신생아 송아지 혈청 | Dutscher | 50750-500 | |
| 적혈구 용해 용액 | BD Bioscience | 555899 | |
| 메스 | Fisher Scientific | 12308009 | |
| 가위 | Euronexia | C-165-ASB | |
| 멸균 1 mL 주사기 | BD Bioscience | 303172 | |
| 멸균 15mL 튜브 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 멸균 5mL 폴리 프로필렌 튜브 | Falcon | 352063 | |
| 멸균 5mL 폴리스티렌 튜브 | Falcon | 352054 | |
| 70µ의 멸균 튜브; m 세포 스트레이너 캡 | Falcon | 352235 | |
| 멸균 페트리 접시 | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | 세포 분류 |
| 튜브 롤러 | 벤치 마크 과학 | R3005 |
참고문헌
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
