여기서, 우리는 골수 각질 방법을 자세히, 샘플 준비에서 현미경 슬라이드 분석에, 프로 플라츠판을 형성하는 그들의 생리 환경에서 분화 한 메가 카요 세포의 능력을 평가하기 위해.
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이 논문에서
요약
초록
메가카요포이시스의 마지막 단계는 성숙한 거대 카르요세포, 소위 프로플라츠에서 세포질 확장으로 이어집니다. 체외에서 -분화 된 메가 카요세포를 사용하여 프로 플라츠판 형성에대해 많은 것을 배웠습니다. 그러나, 기존의 문화 시스템이 골수 내부의 장소를 취하는 분화 / 성숙 과정을 충실하게 재구성하지 않는다는 증거가 증가하고 있다. 이 원고에서는 1956년 티에리와 베시스가 원래 설명한 절묘한 방법을 제시하여 자신의 토착 환경에서 성숙한 거대 카르요세포들을 시각화하여 잠재적인 유물과 오해를 우회합니다. 신선한 골새끼는 마우스의 대퇴골을 플러시하여 수집되고, 0.5mm 단면으로 슬라이스하고, 생리적 완충액을 함유하는 37°C의 인큐베이션 챔버에 배치된다. 메가카요세포는 축출 주변에서 점진적으로 볼 수 있게 되고 비디오 카메라에 결합된 반전된 현미경으로 최대 6시간까지 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라, 메가 카요 세포는 구형 형태를 가지고 다른 두꺼운 확장을 개발하거나 광범위한 분기와 많은 얇은 proplatelet을 확장, 모양을 변경합니다. 정성적 및 정량적 조사가 모두 수행됩니다. 이 방법은 수많은 거대 카르요세포가 존재하므로 간단하고 재현 가능하며 빠르며, 그 중 절반은 배양 마우스 메가카요세포에 대한 4일에 비해 6시간 만에 프로플라틀렛을 형성한다는 장점이 있다. 돌연변이 마우스의 연구 외에도, 이 방법의 흥미로운 적용은 배양에서 발생할 수 있는 분화 과정을 방해하지 않고, 프로플라틀 확장 과정에 대한 약리학제제의 간단한 평가이다.
서론
골수 각질 기술은 1956년 티에리와 베시스에 의해 처음 개발되어 혈소판 형성1의초기 이벤트로서 쥐 메가카요세포 세포질 확장의 형성을 기술하였다. 위상 대비 및 촬영 기술을 사용하여, 이 저자는 신장과 수축의 동적 움직임을 보여주는 세포질 확장과 "오징어 같은"혈전 세포로 성숙한 둥근 메가 카요세포의 변환을 특징으로. 이 팔은 팔을 따라 그리고 끝에서 작은 붓기와 filiform될 때까지 점진적으로 얇아집니다. 시험관 및 액체 매체에서 얻어진 이러한 전형적인 메가카요세포 신장은 고정형 골수에서 관찰된 혈소판과 일정한 유사성을 가지며, 여기서 거대 카르요퀴트는 혈중 벽으로 시누치성 벽을 통해 긴 연장을 돌출하여 혈액 순환2,3로돌출된다. 1994년 TPO의 발견 및 복제는 골수 에 기재된 것과 유사한 프로플라틀 확장을 형성할 수 있는 배양에서 메가카르요사이클을 구별할 수 있게4,5,6. 그러나, 메가카요세포 성숙은 배양 조건에서 훨씬 덜 효율적이며, 특히 골수 성숙 ....
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프로토콜
모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다.
1. 시약 준비
- 표 1에설명된 대로 시약을 준비한다.
- 스톡 I의 경우 각 분말을 별도로 녹입니다. 준비의 진동이 295 mOsm / L보다 높은지 확인하십시오. 이 용액은 1 년 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
- Tyrode의 버퍼 준비를 위해 표 1에설명된 대로 솔루션을 만들고 증류수로 100mL로 볼륨을 조정하고 0.1g 의 무수D(+) 자당을 추가합니다. 필요에 따라 1 N HCl을 사용하여 pH 7.3에 적응하고 295 mOsm / L로 진동합니다. 세균성 성장을 방지하기 위해, 페니실린 G를 추가 10 U/mL 최종 농도 및 연쇄절제술 황산염 0.29 mg/mL 최종 농도. 0.22 μm 모공을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다.
2. 실험 설정 준비
- 실험 당일, 37°C에서 티로드의 완충액을 따뜻....
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결과
질적 결과. 실험의 시작 부분에서, 모든 세포는 골수 단면도에서 압축됩니다. 세포가 각성의 주변에서 명확하게 보이려면 30분이 걸립니다. 메가카요세포는 큰 크기로 인식될 수 있으며, 그 진화는 시간이 지남에 따라 연구될 수 있다(크기, 모양, 동적, 프로혈소판 연장 및 혈소판 방출)(그림2A). 작은 거대 카르요세포는 직경 20에서 30 μm 사이이며, 성숙한 둥근 메가카요세포는 확대된 세포질로 더 큽니다(직경 > 30μm). 몇 가지 어두운 메가카요세포가 관찰될 수있다(도 2C). 이들은 0.5%를 초과해서는 안 되는 죽은 세포를 나타냅니다. 이 값보다 높은 비율은 샘플 준비 문제를 나타냅니다. 핵의 형태는 초점을 변화시킴으로써 쉽게 시각화될 수 있다.
정량적 결과. 메가카요세포는 6.2에 설명된 대로 수동.......
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토론
여기에서 우리는 골수에서 성장한 프로혈소를 확장하기 위하여 거대 karyocytes의 효율성을 평가하는 간단하고 저렴한 체외 방법을 기술합니다. 마우스에 대한 골수 각질 모델은 네 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 고급 기술 기술이 필요하지 않습니다. 둘째, 메가카요세포-연장 프로플라틀을 얻는 데 필요한 시간은 매우 짧고, 절제 방법에 대해서만 6시간밖에 되지 않는데, 이는 마우스 전조자로부터 시작되는 종래의 배양 방법에 대한 최소 4일에 비해 이다. 셋째, 소량의 조직만이 필요하며 얻어진 결과가 재현가능하다는 점을 감안할 때, 최소(보통 실험 조건당 6마우스)에 필요한 마우스의 수를 감소시켜 이러한 실험을 경제적이고 윤리적으로 효율적으로 만듭니다. 마지막으로, 그러나 중요한 것은, 이 방법의 힘은 그들의 자연 환경에서 완전히 발전한 거대 카르요세포의 사용에 있습니다, 문화 조건의 잠재적인 유물에 의해 시험관에서 가려질 수 있는 표현형을 드러내는 귀중한 증명할 수 있는. 이것은 이전에 생체
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자들은 장 이브 린켈, 줄리 보셔, 패트리샤 래퍼, 모니크 프룬드, 케티 크네즈-히퍼트에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01 및 ANR-18-CE14-0037에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 주사기 | Terumo | SS + 05S1 | |
| 21 게이지 바늘 | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| 커버 월 배양 챔버 | 전자 현미경 과학 | 70324-02 | 깊이 : 0,2 mm |
| HEPES | 시그마 | H-3375 | pH 조정 to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | 승인 약물 : n° 3400956446995 | 20%(200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 |
| mm 현미경 | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | 에어 렌즈 |
| 현미경 카메라 | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | 이미지 해상도 : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4. H2O | 시그마 | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL 페니실린, 10,000 μ g/mL 스트렙토마이신 및 29.2mg/mL 글루타민 |
| 면도날 | 전자 현미경 과학 | 72000 | |
| 설탕 D (+) | Sigma | G8270 |
참고문헌
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P.
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재인쇄 및 허가
