세포 성숙을 개선하고 강성과 감금의 영향을 연구하기 위해 3D 메틸셀룰로오스 기반 하이드로겔의 메가카요세포 배양

요약

이제 세포의 3차원 환경이 행동, 성숙 및/또는 분화에서 중요한 역할을 할 수 있음을 인정합니다. 이 프로토콜은 거대 카르요세포에 대한 물리적 봉쇄 및 기계적 제약의 영향을 연구하도록 설계된 3차원 세포 배양 모델을 설명합니다.

초록

감금과 기계적 제약으로 이어지는 3D 환경은 세포 행동의 중요한 결정요인으로 점점 더 인식되고 있습니다. 따라서 3D 배양은 생체 내 상황에 더 잘 접근하기 위해 개발되었습니다. 메가카요세포는 골수(BM)에서 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와 분화한다. BM은 뼈 안에 갇혀 있는 신체의 가장 부드러운 조직 중 하나입니다. 뼈는 세포 규모에서 제대로 확장되지 않으며, 메가카요세포는 약한 강성과 높은 감금을 수반한다. 이 프로토콜은 면역 자기 분류에 의한 마우스 계보 음성(Lin-) HSPC의 회수 방법을 제시하고 메틸셀룰로오스로 구성된 3D 배지에서 성숙한 메가카요사이클로 분화한다. 메틸셀룰로오스는 메가카요세포로 반응하지 않으며 그 강성은 정상적인 골수에 맞게 조정되거나 병리학적인 섬유질 골수를 모방하기 위해 증가될 수 있다. 추가 세포 분석을 위해 메가카요세포를 복구하는 프로세스는 또한 프로토콜에 상세합니다. 프로플라츠판 확장은 3D 밀리유 내에서 방지되지만, 액체 배지에서 거대 카르요퀴트를 재중단하고 프로플라츠를 확장하는 능력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 3D 하이드로겔에서 자란 메가카요세포는 액체 밀리우에서 자란 것과 비교하여 프로플라츠를 형성하는 더 높은 용량을 가지고 있습니다. 이러한 3D 배양은 i)가 더 높은 성숙 상태에 도달하는 메가카르요세포쪽으로 선조들을 구별할 수 있게 하고, ii) 생체내에서 관찰될 수 있지만 고전 액체 배양에서 주목받지 못하는 표현형을 회수하고, iii) 3D 환경에 의해 제공되는 기계적 단서에 의해 유도된 변환 경로를 연구할 수 있다.

서론

본체내 세포는 복잡한 3D 마이크로환경을 경험하고, 인접한 세포와 주변 매트릭스 ^1,2,3로인한 조직 및 감금으로부터의 강성을 포함하는 화학적 및 메카노물리적 단서 간의 상호작용을 받는다. 세포 행동에 대한 강성과 감금의 중요성은 지난 수십 년 동안만 인식되었습니다. 2006년, Engler 외 ^4의 정액 작업은 세포 분화를 위한 기계적 환경의 중요성을 강조했습니다. 저자는 세포 기질 강성의 변이가 다양한 분화 혈통을 향해 줄기 세포의 방향을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 그 이후로, 세포 운명과 행동에 기계 단서의 영향은 점점 인식되고공부되고있다. 그것은 유기체의 가장 부드러운 조직 중 하나임에도 불구하고, 골수는 뼈 안에 갇혀 있는 3D 구조 조직을 가지고 있습니다. 골수 강성은 기술적으로 정확하게 측정하기 어렵지만 15 ~300 Pa ^5,6사이에 있는 것으로 추정됩니다. 스트로마 내에서 세포는 서로 단단히 제한됩니다. 또한, 그들 대부분은 혈액 순환을 입력 ....

프로토콜

모든 실험은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되어야합니다. 비디오에 표시된 모든 프로토콜은 유럽 법과 Etablissement Français du Sang (EFS)의 검토 위원회의 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜의 첫 번째 버전은 원래 분자 생물학 ^8의방법에서 2018 년에 발표되었다.

참고: 그림 1은 전체 프로세스에 대한 회로도를 제공합니다. 이 과정에는 1) 골수 세포의 골해부, 골수 검색 및 기계적 절연, 2) 계보 음성(Lin-) 세포, 3) 액체 또는 메틸셀룰로오스 하이드로겔에서 파종, 액체 배지의 프롬플래틀 형성을 검사하기 위해 3D 젤로 자란 메가카요퀴테의 재현수 등이 포함된다.

1. 성인 마우스의 뼈 컬렉션

참고: 이 섹션에서는 미생물 오염을 최소화하는 것이 중요합니다.

1. 덜벡코의 수정 독수리 매체(DMEM)로 뼈 수집을 위한 15mL 튜브를 준비하여 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG) 항생제 믹스(페니실린 10000 U/mL, 연쇄토마이신 10000 μg/mL/L....

결과

이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 원래 2016 년^9에혈액에 게시되었습니다.

프로토콜에 따르면, 세포는 액체 또는 메틸셀룰로오스 하이드로겔 배지에서 시드되었다. 액체 매체의 세포는 모두 딱딱한 플라스틱 표면과 접촉하고 다른 세포와 언젠가 접촉하여 우물 의 바닥에 퇴적되어 있습니다. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 내장된 세포는 겔에 균질하게 분포되고 이웃 세포로부터 분리된다(도3A). 메틸셀룰로오스 겔은 최종 농도에서 2%의 매우 약간 증가하여 액체 배양(도3B)에비해 평균 메가카요사이클지름을 매우 약간^{증가시킨다고}보고된 9. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 농도를 0.5% 증가시킴으로써 더 작은 평균직경(도 3B)에도시된 바와 같이.......

토론

지난 10 년 동안, mechanobiology생물학은 생물학의 많은 지역에 점점 더 많은 관심을 제기했습니다. 이제 세포를 둘러싼 기계적 환경이 그들의 행동에 중요한 역할을 한다는 것을 일반적으로 인정하며, 메가카르요세포가 세포외 기계적 단서를 감지하고 반응하는 방법을 연구하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다. 특히 대형 포유류의 궤적 뼈 내부에 위치하고 있는 조혈적 붉은 골수를 고려하는 경우, 특히 치석에서 골수 조직의강성을 정확하게 측정하는 것은 어려운 일이며, 당뇨병으로부터 더 쉽게 접근할 수 있는 골수는 본질적으로 지방분(yellow marrow)^12로구성된다. 당뇨병이 본질적으로 빨간 골수를 포함하는 마우스에서 고립된 골수의 경우, 또 다른 문제는 일단 뼈에서 추출되면 조직이 응집력을 유지하지 않는다는 것입니다. 그러나, 신과 협력자는 원자력 현미경을 사용하여 마우스 diaphysis 골수 강성을 측정하고 e_.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
18 게이지 바늘	Sigma-Aldrich	1001735825
21 게이지 바늘	BD Microlance	301155
23 게이지 바늘	Terumo	AN*2332R1
25 게이지 neeldes	BD Microlance	300400
4웰 배양 접시	Thermo Scientific	144444
5 mL 주사기	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
필터 카드가 장착된 Cytofunnels	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin 원심분리기	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	라이프 테크놀로지	14190-094	멸균 둘베코' s 인산염 완충 식염
EasySep 자석	줄기세포 기술	18000
EasySep 마우스 조혈전구세포 분리 키트	줄기세포 기술	19856A	바이오틴화 항체 (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7– 4) 및 streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL 주사기	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	또는 BD MEDICAL의 309628 주사기
Luer lock 주사기 커넥터	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R& 앰프; D 시스템	HSC001
폴리리신 코팅 슬라이드	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL 페니실린, 10,000 μ g/mL 스트렙토마이신 및 29.2mg/mL 글루타민
쥐 혈청	줄기 세포 기술	13551
재조합 히루딘	트랜스지&에그레이브; ne	rHV2-Lys47
재조합 인간 트롬보포이에틴(rhTPO)	줄기세포 기술	2822	10,000 units/mL
둥근 바닥 10mL 플라스티크 튜브	Falcon	352054
둥근 바닥 5mL 폴리스티렌 튜브

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