표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링

요약

표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 하에서의 절단은 효율적인 크로마틴 에피게놈 프로파일링 전략이다. 이 프로토콜은 식물에서 히스톤 수정의 프로파일 링을위한 세련된 CUT & Tag 전략을 제시합니다.

초록

DNA 및 히스톤 변형, 전사 인자의 거동 및 모집된 단백질과의 비코딩 RNA를 포함하는 색채 수준에서의 에피게놈 조절은 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절을 유도한다. 표적 및 태멘테이션 하에서의 절단(CUT&Tag)은 특정 크로마틴 단백질이 먼저 특정 항체에 의해 인식되고, 그 다음에 항체가 단백질 A-트랜스포자제(pA-Tn5) 융합 단백질을 테더링하는 효소-테더링 방법으로, 마그네슘 이온의 활성화에 의해 표적 염색질을 현장에서 절단한다. 여기에서, 우리는 수정과 함께 allortetraploid 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하여 이전에 발표 된 CUT&Tag 프로토콜을 제공합니다. 이 단계별 프로토콜은 식물의 후성 게놈 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 식물 핵 분리에 대한 실질적인 변형은 비판적인 논평과 함께 제공된다.

서론

히스톤 변형 마크와 관련된 전사 인자 결합 DNA 부위 및 오픈 크로마틴은 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 기능적 역할을 하며 후성유전학 연구의 주요 초점입니다¹. 종래에는 딥 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역침전 분석법(ChIP)이 특정 단백질을 이용한 특정 크로마틴 히스톤 변형 또는 DNA 표적의 게놈 전반의 동정을 위해 사용되어 왔으며, 후성유전학² 분야에서 널리 채택되고 있다. 표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 기술 하에서의 절단은 원래 Henikoff Lab에 의해 게놈 전체에 걸쳐 단백질 제휴 DNA 단편을 포획하기 위해 개발되었습니다⁵. ChIP와 비교할 때, CUT&Tagcan은 단순화된 절차로 소수의 세포를 사용하여 고해상도와 매우 낮은 배경에서 DNA 라이브러리를 생성합니다³. 현재까지 CUT&Tag를 이용한 특이적 히스톤 변형을 갖는 크로마틴 영역을 분석하기 위한 방법이 동물 세포^4,5에서 확립되었다. 특히, 단일 세포 CUT&Tag(scCUT&Tag)도 인간 조직 및 세포를 위해 성공적으로 개발되었습니다⁶. 그러나 세포벽과 이차 대사 산물의 복잡성으로 인해 CUT&TAG는 여전히 식물 조직에 기술적으로 도전적입니다.

이전에 우리는 동종 테트라 플로이드 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하는 CUT&Tag 프로토콜을보고했습니다⁴. 식물 조직을 이용한 핵 분리 및 DNA 포획의 효율성을 입증하기 위해, 프로파일링 절차가 여기에 제시된다. 주요 단계는 무손상 핵 단리, 크로마틴 변형을 위한 항체와의 계내 인큐베이션, 트랜스포자제 인큐베이션, 어댑터 통합, 및 DNA 라이브러리 준비를 포함한다. 문제 해결은 식물 핵 분리 및 품질 관리를 위한 CUT&Tag 라이브러리 준비에 중점을 둡니다.

이 연구에서는 식물에 대한 세련된 CUT&Tag 전략을 제시합니다. 우리는 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을위한 단계별 프로토콜을 제공 할뿐만 아니라 적절한 세포 용해를위한 세제 농도를 선택하는 전략과 핵을 필터링하는 전략을 포함하여 식물 핵 분리를위한 최적화 된 방법론을 제공합니다. 중요한 의견이 있는 자세한 단계도 이 업데이트된 프로토콜에 포함되어 있습니다.

프로토콜

1. 트랜스포자제 및 스톡 용액 준비(1일차)

참고: 이 부분에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터는 활성 트랜스포자제를 만들기 위해 Tn5 트랜스포자제와 복합체화된다.

1. 어닐링 완충액 (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 사용하여 프라이머 (프라이머 A, 프라이머 B 및 프라이머 C)를 100 μM 농도로 희석한다 (작업 용액에 대한 제조법에 대해서는 프라이머 및 표 2의 서열 정보는 표 1 참조). 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오.
2. PCR 튜브에 다음의 두 반응을 설정한다: 반응 1 (어댑터 AB), 100 μM의 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 B; 반응 2 (어댑터 AC), 10 μL의 100 μM 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 C.
3. 다음 프로그램을 사용하여 PCR 기계에서 어댑터를 어닐링한다: 히트 리드 (102°C), 15분 동안 75°C, 10분 동안 60°C, 10분 동안 50°C, 10분 동안 40°C, 30분 동안 25°C.
   참고: 어댑터는 부분적으로 이중 가닥 DNA 분자입니다(농도 = 50 pmol/μL).
4. 1.5 mL 원심분리 튜브에서 다음 반응을 설정하십시오: 10 μL의 pA-Tn5 트랜스포자제 (500 ng/μL 또는 7.5 pmol/μL), 0.75 μL의 어댑터 AB (50 pmol/μL), 0.75 μL의 어댑터 AC (50 pmol/μL), 7 μL의 커플링 버퍼. 피펫 20x를 부드럽게 잘 섞어서 1시간 동안 수조에서 30°C에서 인큐베이션한다. 트랜스포자제의 최종 농도 = 4 pmol/μL. 사용 전까지 -20°C에서 보관한다.
   참고: 어댑터 AB의 몰 비율: 어댑터 AC: 트랜스포자제 = 0.5:0.5:1.
5. 표 2에 제공된 제조법에 따라 스톡 용액을 준비하고, 스톡 용액을 오토클레이브 또는 여과하여 멸균한다.
6. 오토클레이브 및 가위, 여과지, 스테인리스 스틸 체, 모르타르, 유모차 등을 살균합니다.

2. 핵 분리 (2 일째)

1. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각시킨다. 출발물질(면잎) 각 1 g에 대해, 25 mL의 핵 분리 완충액 A(10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 준비하고, 20 mL의 핵 분리 완충액 B(10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL의 핵 세척 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%), 항체 완충액 1 mL (50 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 1 mg/mL BSA, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 0.05% w/v 디지토닌). 튜브를 사용할 때까지 얼음 위에 놓으십시오.
2. 액체 질소에서 신선한 잎 (~ 1 g)을 미세 분말로 갈아서 25 mL의 냉각 핵 분리 버퍼 A가 들어있는 50 mL 튜브로 옮깁니다.
3. 완충 용액을 부드럽게 혼합하고 튜브를 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션하여 부드럽게 흔들어 물질을 고르게 분산시킵니다.
4. 4°C에서 500 rcf에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하였다.
5. 상청액을 데칸트하고, 0.5% 트리톤 X-100으로 보충된 냉각된 핵 분리 완충액 B의 20 mL로 펠렛을 재현탁시켰다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 펠렛을 완전히 재현탁시킵니다.
   참고: 20mL 핵 분리 버퍼 B는 출발 물질 1g에 적용 가능하며, 이에 따라 부피를 조절할 수 있습니다.
   1. 파일럿 분석을 수행하여 트리톤 X-100의 직렬 농도의 효과를 시험한다 (예를 들어, 분쇄된 조직 100 mg에 대해 각각 0.1%, 0.25%, 0.5%, 및 1% 트리톤 X-100을 갖는 2 mL 핵 분리 완충액 B). Triton X-100의 적절한 농도는 바닥에 흰색 / 회색 핵이 축적되고 저속으로 용해 및 원심 분리 후 짙은 녹색 상청액이 축적되어 표시됩니다 (4 분 동안 < 500 rcf).
6. 생성 된 세포 용해물을 두 개의 체로 필터링하십시오 : 상단의 500 메쉬 체는 더 큰 조직 파편을 제거하고 하단에는 1000 메쉬 체를 사용하여 핵을 수집합니다.
   참고 : 식물의 핵 크기에 따라 체에 적합한 메쉬 크기를 선택하십시오.
7. 체 뒷면에 멸균 여과지를 사용하여 용해물의 작은 세포 파편을 흡수하십시오.
8. 용해물을 함유하는 나머지 핵을 1000 메쉬 체의 윗면에 네 개의 신선한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
9. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다.
10. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 핵 세척 완충액으로 펠렛을 세척하십시오.
11. 800 μL의 핵 세척 완충액을 첨가하고 튜브를 부드럽게 반전시켜 펠렛을 재현탁시킨다. 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 다시 회전시킨다.
12. 총 3 번의 세척을 수행하십시오.
13. (선택 사항) DAPI 염색을 위해 현미경으로 핵을 이미지화한다.
    1. 100 μL의 핵 현탁액을 단계 2.11로부터 핵 세척 완충액으로 옮긴다. 새로운 1.5 mL 튜브에. 900 μL의 핵 세척 완충액과 2 μL의 DAPI 원액 (1 mg / mL)을 첨가하여 DAPI에 대해 2 μg / mL의 최종 작업 농도를 만듭니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
    2. 염색 후, 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다.
    3. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하십시오. 800 μL의 핵 세척 완충액으로 3회 세척한다.
    4. 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 핵 세척 완충액 100μL로 핵을 재현탁시킨다.
    5. DAPI 채널을 사용하여 형광 현미경으로 핵을 이미지화한다.
14. 두 개의 튜브 (각 1.5 mL 튜브에서 부피가 ~ 50 μL의 핵)에서 핵을 결합하십시오. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 최대한 제거하십시오.

3. 항체 배양

1. 각 50 μL의 핵을 1.5 mL 튜브에 1 mL의 항체 완충액과 함께 재현탁시킨다.
2. 각 튜브에 150 μL의 핵(~1 μg의 크로마틴)과 2 μL의 IgG(1 mg/mL)를 갖는 IgG 대조군의 2개의 생물학적 복제물, 각 튜브에 150 μL의 핵과 2 μL의 항-H3K4me3 항체(1 mg/mL)를 갖는 H3K4me3 분석 그룹의 두 개의 생물학적 복제물.
3. 용액을 부드럽게 혼합하고 튜브를 4°C 및 12 rpm에서 하룻밤 동안 혼성화를 위해 수평 진탕기 상에 방치한다.
4. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각시킨다. 50 mL 원심분리 튜브에서 신선한 50 mL의 면역침전(IP) 세척 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, ,0.05% w/v 디지토닌)을 준비한다. 튜브를 얼음 위에 앉히십시오.
5. 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 각 튜브에서 항체 완충액을 분리한다.
6. 800 μL의 IP 세척 완충액을 각 튜브에 첨가하고 부드럽게 혼합하십시오. 튜브를 실온에서 5 분 동안 수평 쉐이커에 놓고 12 rpm으로 두십시오.
7. 세척 후, 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하십시오.
   참고 : 핵 펠릿의 교란을 피하려면 ~ 50-80 μL의 완충액을 핵과 함께 두십시오.
8. 3.6.-3.7단계를 반복합니다. 두 번 더.
9. 세 번째 세척 후, 4°C에서 300 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하십시오.

4. 트랜스포자제 인큐베이션

1. IP 세척 완충액 1 mL를 5 M NaCl 중 30 μL와 혼합하여 신선한 트랜스포사제 인큐베이션 완충액 (10 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 0.05% w/v 디지토닌)을 만드십시오.
2. 인큐베이션을 위한 Tn5 트랜스포자제 믹스를 제조하기 위해, 트랜스포자제 인큐베이션 완충액의 각 150 μL에 트랜스포자제 1 μL를 첨가한다.
   주: 반응 횟수에 따라 먼저 트랜스포자제 용액 믹스를 준비한 다음, 각 튜브에 150 μL의 분취량을 첨가한다.
3. 핵을 150 μL의 트랜스포사제 용액으로 재현탁시킨다.
4. 튜브를 실온에서 2-3 시간 동안 12 rpm의 수평 쉐이커에 놓고 10-15 분마다 혼합하십시오.
5. 트랜스포자제 인큐베이션 후, 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 트랜스포사제 인큐베이션 완충액을 각 튜브에서 제거한다.
6. IP 세척 버퍼로 튜브를 세척하십시오. 이렇게 하려면 각 튜브에 800μL의 IP 세척 버퍼를 넣고 부드럽게 혼합한 다음 튜브를 실온에서 5분 동안 12rpm의 수평 진탕기에 둡니다.
7. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하십시오.
8. 4.6.-4.7단계를 반복합니다. 두 번 더.
9. 세 번째 세척 후, 4°C에서 300 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하십시오.

5. 태그 지정

1. 2 mL의 태멘테이션 완충액 (10 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 10 mM _MgCl2, 0.05% w/v 디지토닌)을 2 mL의 IP 세척 완충액과 60 μL의 5 M NaCl 및 20 μL의 1 M _MgCl2와 혼합하여 갓 만든다.
2. 핵을 300μL의 태멘테이션 버퍼로 재현탁시킨다.
3. 용액을 혼합하고 태깅을 위해 1 h 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.
4. 10 μL의 0.5 M EDTA (최종 농도∼15 mM) 및 30 μL의 10% SDS (최종 농도 1%)로 태깅을 중단한다.

6. DNA 추출 및 NGS 라이브러리 구축

1. ⁷에 기재된 바와 같이 300 μL의 CTAB DNA 추출 완충액을 첨가한다. 튜브를 65°C 수조에서 30분 동안 인큐베이션한다. ~ 10 분마다 혼합하도록 반전하십시오.
2. 600 μL의 페놀:클로로포름: 이소아밀 알코올(25:24:1)을 각 튜브에 첨가한다. 철저히 섞으십시오.
3. 상잠금겔 튜브를 4°C에서 13,000 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 상기 용액을 위상 잠금 겔 튜브로 옮깁니다.
4. 4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.
5. 상청액(∼600 μL)을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
6. 600 μL의 클로로포름을 각 튜브에 첨가하십시오. 철저히 섞으십시오.
7. 4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.
8. 상청액 (∼600 μL)을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮긴다.
9. 12 μL의 100% 에탄올과 2μL의 글리코블루 공침제를 첨가한다. 완전히 혼합하고 -20°C에서 1시간 동안 보관한다.
10. 4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.
11. 상층액을 데칸트하십시오. DNA 펠릿을 75% (v/v) 에탄올을 사용하여 세척하고 4°C에서 13,000 rcf에서 5분 동안 원심분리한다.
12. 상층액을 데칸트하십시오. DNA 펠릿을 공기-건조시키고 DNA를 25 μL의 _ddH2O에 재현탁시켰다.
13. PCR 반응을 다음과 같이 설정한다. 총 50 μL의 반응을 위해, 24 μL의 DNA, 11 μL의 _ddH2O, 10 μL의 5x TAE 완충액, 2 μL의 P5 프라이머 (10 μM), 2 μL의 P7 프라이머 (10 μM) 및 1 μL의 TruePrep 증폭 효소를 첨가한다. PCR 프로그램: 3분 동안 72°C, 30초 동안 98°C; 그 후 30초 동안 98°C, 30초 동안 60°C, 30초 동안 72°C의 14 사이클을 거쳐 5분 동안 72°C로 사이클하였다.
    참고: 연장을 위해 3분 동안 처음 72°C는 건너뛸 수 없습니다 . 라이브러리의 과다 증폭은 NGS에서 높은 수준의 PCR 중복을 초래할 것이다. 각 반응에서 ∼1 μg의 크로마틴을 사용할 때 H3K4me3에 대한 PCR 반응에서 12-14 PCR 사이클부터 시작한다.
14. PCR 산물 2 μL를 전기영동을 위해 1.5% 아가로스 겔에 로딩한다.
15. 상용 DNA 정제 자석 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제한다.
16. 라이브러리를 형광계 및 아가로스 겔 전기영동으로 정량화한다.
    참고: 라이브러리의 유효 농도는 양호한 품질을 보장하기 위해 qPCR에 의해 >2 nM이어야 합니다.
17. 차세대 염기서열 분석(NGS) 및 데이터 분석을 수행합니다.

결과

그림 1은 CUT&Tag 워크플로를 보여 줍니다. 도 2는 무손상 핵의 DAPI 염색을 나타낸다. "핵 분리" 단계의 목표는 후속 CUT&Tag 반응을 위해 충분한 양으로 온전한 핵을 수득하는 것이었다. 도 3은 PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동을 나타낸다. IgG 음성 대조군은 실험을 설정할 때 병렬로 요구된다. IgG 대조군과 비교하여, H3K4me3 항체 샘플로 뽑아낸 DNA 단편의 벌크는 ∼280 내지 500 염기쌍 범위였다. 도 4 는 IgG 음성 대조군과 비교하여 항-H3K4me3 항체에 대한 결과적인 차세대 시퀀싱을 보여준다.

토론

여기에서는 염색질 면역침전(ChIP)에 비해 절차가 단순화된 적은 수의 세포를 사용하여 고분해능과 매우 낮은 배경으로 DNA 라이브러리를 생성하는 기술인 CUT&Tag에 대해 설명했습니다. 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을 성공적으로 수행 한 것은 동물 세포를 위해 처음 설계된 CUT & Tag가 식물 세포에도 사용될 수 있음을 시사합니다. ChIP ^assay8에 일반적으로 사용되는 트리스 버퍼 시스템과 동물 CUT&Tag에 사용되는 HEPES 버퍼 시스템은 식물 핵^을 사용하는 CUT&^Tag4,9에 대한 작업을 수행합니다. 손상되지 않은 식물 핵의 분리는 식물에 CUT&Tag를 성공적으로 적용하기 위한 중요한 단계입니다. 핵 ^분리4에 대한 이전에 보고된 방법론에서, 분쇄된 조직의 용액을 세포 용해 전에 미라클로스의 두 층을 통해 여과...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
소 혈청 알부민(BSA)			10 mg/ml BSA 원액을 만듭니다. -20°C에 저장하십시오. C
디지토닌(~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	5% 디지토닌 원액(200mg 디지토닌[~50% 순도]에서 2mL DMSO)을 만듭니다. 참고 : 0.22미크론 필터를 사용하여 살균하십시오. -20°C에 저장하십시오. C
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)
클로로포름
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)			0.5 M EDTA (pH = 8.5) 원액을 만듭니다. 참고: 100mL의 0.5-M EDTA(pH = 8.5)를 만들려면 pH
GlycoBlue Coprecipitant(15mg/mL)	Invitrogen	AM9516
염화마그네슘(MgCl2)			1M MgCl2 원액
프로테아제 억제제 칵테일	Calbiochem 만들기	539133-1SET
염화칼륨(KCl)			1M KCl 원액
만들기 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1,v:v:v)
염화나트륨(NaCl)			5M NaCl 원액
스페르미딘			2M 스페르미딘 원액 만들기, -20°C에서 보관.
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)			10 % SDS 원액을 만듭니다. 참고: 오토클레이브하지 마십시오. 0.22 미크론 필터를 사용하여 살균
Tris base			1 M Tris (pH = 8.0) 원액
Triton X-100			제조 20 % Triton X-100 원액
Enzyme< / strong>
Cut& 용 pA-Tn5 전이 효소 / 강 pA-Tn5 전이 효소 태그	Vazyme	S602/S603	Tn5와 융합된 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 친화도를 확인합니다. 일반적으로 단백질 A와 G는 광범위한 항체 친화력을 가지고 있습니다. 그러나 단백질 A는 토끼 항체에 대해 상대적으로 더 높은 친화력을 가지며 단백질 G는 마우스 항체에 대해 상대적으로 더 높은 친화력을 갖습니다. 항체와 일치하는 적절한 transposase 산물을 선택하십시오.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  분광 광도계	Thermo Scientific	ND-원-W