헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

요약

헤모필루스 인플루엔자는 호흡기에서 염증을 유발합니다. 이 기사에서는 이 박테리아에 대한 반응으로 식세포와 림프구에 의한 면역 반응을 정의하기 위해 유세포분석 및 컨포칼 현미경을 사용하는 방법에 중점을 둘 것입니다.

초록

헤모필루스 인플루엔자 (Hi)는 다양한 호흡기 질환에서 발견되는 널리 퍼진 박테리아입니다. 이 박테리아에 대한 호흡 면역/염증 반응을 평가하기 위해 다양한 분석/기술을 사용할 수 있습니다. 유세포분석 및 컨포칼 현미경은 생물학적 반응의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 형광 기반 기술입니다. 세포벽 성분, 사멸/불활성화 제제 및 살아있는 박테리아를 포함한 다양한 형태의 Hi 항원을 사용할 수 있습니다. Hi는 농축 배지가 필요한 까다로운 박테리아이지만 일반적으로 표준 실험실 환경에서 쉽게 자랄 수 있습니다. 히히로 자극하기 위한 조직 샘플은 말초 혈액, 기관지 내시경 검사, 또는 절제된 폐 (예를 들어, 폐암의 치료를 위해 수술을 받는 환자에서)로부터 수득될 수 있다. 대식세포 및 호중구 기능은 식균작용, 활성 산소 종 및 세포내 사이토카인 생산을 포함하는 측정된 다양한 파라미터와 함께 유세포분석을 사용하여 포괄적으로 평가될 수 있다. 림프구 기능 (예를 들어, T 세포 및 NK 세포 기능)은 주로 세포내 시토카인 생산을 위해 유동 세포측정을 사용하여 특이적으로 평가될 수 있다. Hi 감염은 호중구 (NET)와 대 식세포 (MET) 모두에 의한 세포 외 트랩 생성의 강력한 유도제입니다. 컨포칼 현미경은 틀림없이 NET 및 MET 발현을 평가하는 가장 최적의 방법이며, 이는 프로테아제 활성을 평가하는 데에도 사용될 수 있습니다. 헤모필루스 인플루엔자에 대한 폐 면역은 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다.

서론

헤모필루스 인플루엔자(Hi)는 대부분의 건강한 성인의 인두에 존재하는 정상적인 공생 박테리아입니다. 다당류 캡슐 (유형 A-F, 예를 들어, 유형 B 또는 HiB)을 갖거나 캡슐이 결여되어 있고 비유형 (NTHi)¹일 수 있다. 이 박테리아에 의한 점막의 식민지화는 어린 시절부터 시작되며, 다른 식민지 균주의 회전율이 있습니다². 이 박테리아는 또한 상부 및 하부 호흡기 모두를 침범 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 면역 반응^{및 염증 3,4}의 활성화를 유도할 수 있다. 이 염증 반응은 임상 질환을 유발할 수 있으며 부비동염, 중이염, 기관지염, 낭포 성 섬유증, 폐렴 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함한 다양한 중요한 호흡기 상태에 기여할 수 있습니다. 이러한 조건의 대부분은 NTHi 균주²로 인한 것입니다. 이 기사에서는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 Hi에 대한 호흡기 면역 반응을 평가하는 방법을 설명합니다.

하기에 기술된 방법들은 Hi에 대한 염증 반응을 평가하기 위해 ....

프로토콜

이 연구는 Monash Health의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

1. 항원 제제

참고: Hi에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 세 가지 다른 항원 제제를 사용할 수 있습니다. 이들은 1) 세포하 성분 (전형적으로 박테리아 세포벽으로부터); 2) 사멸 및 불활성화 박테리아; 3) 살아있는 박테리아. 임의의 실험의 개시 전에 각 항원 제제의 사용을 결정한다.

1. 세포 내 구성 요소
   1. 상업적 제제, 자체 개발 성분 및/또는 다른 연구자로부터 공급원으로부터 세포내 성분을 얻는다.
      참고: 일반적으로 박테리아 세포벽의 세포하 구성 요소가 사용될 수 있으며 P6 및 리포올리고당(LOS)^11,12와 같은 외부 막 단백질을 포함합니다. 이러한 세포 내 구성 요소는 일반적으로 전문 센터에서 파생됩니다. 어떻게 만들어 졌는지에 대한 설명은이 기사의 범위를 벗어납니다. 이 분야의 전문가와 직접 연락하여 이러한 구성 요소를 얻는 것이 좋습니다.
2. 사멸/비활성화된 박테리아

결과

대표적인 결과는 NTHi에 대한 염증성 면역 반응이 유세포 분석 및 공초점 현미경으로 어떻게 평가 / 정량화 될 수 있는지 보여줍니다. 결과 해석의 핵심 부분은 대조군과 자극 샘플 간의 형광 비교입니다. 일반적으로 샘플의 염색을 최적화하기 위해 많은 예비 실험이 필요합니다. 동시에 검사할 수 있는 색상의 수는 유세포분석기/컨포칼 현미경에서 사용할 수 있는 채널 수에 따라 다릅니다. 폐 단백질 분해를 측정하기 위한 1) ROS 생산, 2) 인간 폐 조직의 세포내 사이토카인 염색, 및 3) 계내 자이뮤 노그래피의 평가에 대한 결과가 표시됩니다.

도 1 은 단핵구에 의한 ROS 생산의 표현을 나타낸다. ROS의 측정은 DHR123의 산화에 의해 형광을 생성한다. 세포는 게이트가 부착되고 중앙 형광은 유세포 분석으로 평가됩니다. 자극된 샘플의 중간 형광을 대조군과 비교한다.

토론

여기에 나열된 방법은 Hi에 대한 염증성 폐 반응에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 함께 사용할 수 있는 형광 기반 유동 세포분석 및 공초점 현미경 기술을 사용합니다.

사용되는 Hi의 적절한 항원 제형을 확립하는 것이 중요하며, 이와 관련하여 미생물학자로부터 구체적인 의견을 듣는 것이 좋습니다. Live Hi는 더 강한 반응을 유도하는 반면, 사멸 Hi 제제 및 Hi 구성 요소는 더 표준화되고 저장하기 쉽습니다. PI는 죽은 박테리아²²에만 라벨을 붙입니다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜에스테르(CFSE)와 같은 다른 염료는 식균작용 분석²³을 위해 살아있는 박테리아를 표지하는 데 사용될 수 있습니다. 적절한 항원을 최적화하기 위해 일련의 예비 실험을 수행해야합니다. 라이브 NTHi를 사용하려면 100:1의 MOI가 최적입니다. 낮은 MOI는 명확한 면역 반응을 유도하지 않을 수 있지만 높은 MO.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화암모늄	시그마 알드리치	213330
브레펠딘	시그마 알드리치	B6542
CD28	써모피셔	16-0289-81
CD49d	써모피셔	534048
DAPI 연장 골드	써모피셔	P36931
DHR123	시그마 알드리치	109244-58-8
Filcon 멸균 나일론 메쉬	Becton Dickinson	340606
젤라틴 기질, Enzchek	분자 프로브	E12055
MACS 믹스 튜브 회전기	Miltenyi Biotec	130-090-753
Medimachine	Becton Dickinson		카탈로그 번호 사용 불가
Medicons 50 µ m	Becton Dickinson	340592
Pansorbin	시그마 Aldrich	507858
Propidium 요오드화물	시그마 Aldrich	P4170
사포닌	시그마 Aldrich	8047152
Superfrost 슬라이드	Thermofisher	11562203