Method Article

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

DOI:

10.3791/62620

⸱

August 14th, 2021

 ,  , 
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura

In This Article

Summary

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신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

Abstract

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신경 근육 접합 (NMJ)은 운동 신경과 골격 근육 사이의 접촉전문 지점입니다. 이 주변 시냅스는 높은 형태학적 및 기능적 가소성을 나타낸다. 수많은 신경계 장애에서, NMJ는 신경 전달 실패의 결과로 초기 병리학 대상, 약점, 위축, 심지어 근육 섬유 죽음. 관련성 때문에 NMJ 구성 요소 간의 관계의 특정 측면을 정량적으로 평가할 수 있어 어셈블리/분해와 관련된 프로세스를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 근육작업 시 첫 번째 장애물은 섬유질을 손상시키지 않고 신속하게 식별하고 해부할 수 있는 기술적 전문 지식을 확보하는 것입니다. 두 번째 과제는 고품질 검출 방법을 활용하여 정량 분석을 수행하는 데 사용할 수 있는 NMJ 이미지를 얻는 것입니다. 이 문서에서는 쥐에서 근간 이수 및 발바닥 근육을 해부하기위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 또한 전체 마운트 NMJs의 사전 및 포스트냅스 요소를 시각화하기 위해 면역 형광의 사용을 설명합니다.

Introduction

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포유동물 신경근육 접합(NMJ)은 운동 신경 신경 결말, 골격 근 섬유의 포스트냅틱 막, 및 말단 슈완 세포1,2,3으로구성된 대형 콜린성 삼자시냅스이다. 이 시냅스는 NMJ가 동적 구조 적 변형을 겪을 수있는 성인기 동안에도 높은 형태학적 및 기능성 가소성4,5,6,7,8을나타낸다. 예를 들어, 몇몇 연구원은 모터 신경 결말이 마이크로미터 규모9에서지속적으로 그들의 모양을 바꾸는 것을 보여주었습니다. 또한 NMJ의 형태는 기능적 요구 사항, 변경된 사용, 노화, 운동 또는 운동 활동의 변화에 반응하는 것으로 보고되었다4,10,11,

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Protocol

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모든 동물 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물 관리를위한 국가 법 N ° 18611의 지침에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 기관 윤리위원회(CEUA IIBCE, 프로토콜 번호 004/09/2015)에 의해 승인되었습니다.

1. 근육 해부 (1일차)

참고: 시작하기 전에 40mL의 0.5% 파라포름데히드(PFA), pH 7.4를 덜벡코의 인산염 식염수(DPBS)에서 확인합니다. 선택적으로, 4 % PFA의 20 mL을 합니다. 5mL 알리코를 준비하고 -20 °C에서 동결하십시오. 해부 당일, 4% 알리쿼트해질하고 35mL의 DPBS를 추가하여 40mL의 0.5% PFA를 얻습니다.

  1. EDL의 격리 (빠른 경련 근육)
    1. 쥐를 안락사시다. 복부가 위쪽으로 향하는 동물을 놓습니다. 발가락 사이의 수술 용 블레이드를 사용하여 뒷사지쪽으로 초기 절개를하십시오.
      참고: 이 경우, 90:10 mg/kg 케타민:자일라진의 관면 주사는 쥐를 안락사시키기 위해 주어졌지만, 마취의 다른 옵션도 허용됩니다.
    2. 쥐 무릎이 노출 될 때까지 위로 당겨, 피부를 벗겨.
    3. EDL을 찾으려면 발 힘줄을 따라 발 성 인....

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Results

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이 프로토콜은 두 가지 유형의 근육 (빠르고 느린 경련 근육, 그림 1참조)에서 면역 스테인 근육 섬유를 분리하고 분리하는 간단한 방법을 제공합니다. 올바른 마커 및/또는 프로브를 사용하여, NMJ 성분은 질병 진행 또는 특정 약물 치료의 결과로 발생할 수 있는 형태학적 변화의 일부를 평가하기 위한 정량적 관점 이후 검출 및 평가될 수 있다. 본 연구에서는, NMJ의 전시냅틱 및 포스트냅스 성분은 각각 항-Nf 또는 항-포스-Nf 항체 및 Btx를 사용하여 형광으로 표지되었다(도2,상부 패널). 면역스테인링 후 얻은 NMJ의 각각의 고해상도 공초점 이미지는 도 2의하단 패널에 기재된 파라미터를 적용하는 프로토콜 섹션(표1)에지정된 형태 측정 및 인덱스를 결정하는 데 사용되었다.

이러한 전산 .......

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Discussion

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이 기사에서는 2개의 쥐 골격 근(느린 경련 과 다른 빠른 경련), 섬유 근육 격리 및 면역 불침식 검출을 위한 상세한 프로토콜을 제시하여 NMJ 변경사항뿐만 아니라 조립/분해 공정을 정량적으로 평가합니다. 이러한 종류의 프로토콜은 ALS hSOD1G93A 랫트에서 발견되는 것과 같은 운동 뉴런 변성의 모델에서 본명술된 바와 같이 생리적 또는 병리학적 과정 동안 NMJ를 평가하는 설치류모델(41)및42에서 유용할 수 있다.

성공과 유익한 결과를 얻으려면 몇 가지 팁을 염두에 두어야합니다. 예를 들어, 설명된 프로토콜은 해부된 근육을 즉시 사용할 수 있게 합니다. 그러나, 근육을 오래 보존하는 데 필요한 경우 0.05% 나트륨 아지드와 4°C 저장으로 DPBS를 사용하면 최대 4주까지 우수한 근육 보존을 연장할 수 있다. 이 옵션을 사용하는 경우 염색 프로세스를 시작하기 전에 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업에 주어진 재정 지원에 대한 CSIC와 PEDECIBA에 많은 감사; 나탈리아 로사노에게 원고 수정; 비디오를 만드는 마르셀로 카사쿠베르타와 니콜라스 볼라토에게 그의 목소리를 빌려주려고 합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시원한 빛 조명이 있는 실체 현미경NikonSMZ-10A
흔들 플랫폼Biometra (WT 16)042-500
커버 안경(24 x 32mm)DeltalabD102432
프리미엄(플러스) 현미경 슬라이드PORLABPC-201-16
핀셋F.S.T11253-20
유니밴드 LA-4C 가위 125mmE.M.S77910-26
Disponsable 수술용 블레이드 #10Sakira Medical1567
Disponsable 멸균 주사기 (1 ml)Sakira Medical1569
Super PAP 펜E.M.S71310
100 μ l 또는 200 μ l 피펫Finnpipette9400130
컨포칼 현미경ZeissLSM 800 - AiryScan
NTac : SD-TgN (SOD1G93A) L26H 쥐Taconic2148-M
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
파라 포름 알데히드시그마158127
트리톤 X-100시그마T8787
글리신Amresco167
BSA바이오 베이직 INC.9048-46-8
글리세롤Mallinckrodt5092
TrisAmresco497
정제 된 항 신경 필라멘트 H (NF-H), 인산화 항체BioLegend801601이전에 Covance # SMI 31P
정제 된 항 신경 필라멘트 H (NF-H), Nonphosphorylated AntibodyBioLegend801701이전에 Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (H+L)Thermo ScientificA11029
α-Bungarotoxin, 비오틴-XX 접합체InvitrogenB1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 접합체InvitrogenS32355
Diaminophenylindole (DAPI)SigmaD8417

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
  2. Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neur....

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