Method Article

래트 무릎의 순환 로딩 유도 관절내 연골 병변 모델을 생성하기 위한 비침습적 방법

DOI:

10.3791/62660

⸱

July 5th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Development and Rehabilitation of Motor Function, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 2Department of Motor Function Analysis, Human Health Sciences, Graduate School of Medicine, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 20N 이상의 60 순환 압박에 의해 생성 된 쥐 무릎의 순환 로딩 유도 관절 내 연골 병변 모델을 제시하여 쥐의 대퇴 과두 연골에 손상을 입 힙니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원발성 골관절염 (OA)의 병태 생리학은 아직 명확하지 않습니다. 그러나 상대적으로 젊은 연령 그룹에서 OA의 특정 하위 분류는 관절 연골 손상 및 인대 경련의 병력과 관련이 있을 수 있습니다. 무릎 OA의 수술 동물 모델은 외상 후 OA의 발병 및 진행을 이해하는 데 중요한 역할을 하며 이 질병에 대한 새로운 치료법 개발을 돕습니다. 그러나 최근 중재 평가에 영향을 미칠 수있는 외상성 염증을 피하기 위해 비수술 모델이 고려되었습니다.

이 연구에서는 생체 내 주기적 압축 하중에 의해 유도된 관절 내 연골 병변 쥐 모델이 개발되어 연구자들은 (1) 국소 연골 손상을 일으킬 수 있는 최적의 하중 크기, 속도 및 지속 시간을 결정할 수 있었습니다. (2) 연골세포 활력의 외상 후 시공간적 병리학적 변화를 평가하고; (3) 관절 압축 하중에 대한 적응 및 복구 메커니즘에 관여하는 파괴 또는 보호 분자의 조직학적 발현을 평가합니다. 이 보고서는 쥐 모델에서이 새로운 연골 병변에 대한 실험 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

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전통적으로 내측 반월판의 전방 십자 인대 (ACL) 절개 또는 불안정화는 작은 동물의 외상 후 골관절염 (PTOA)을 조사하는 데 최적으로 간주되었습니다. 최근 몇 년 동안 비 침습적 순환 압축 모델이 PTOA를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 원래기계적 하중1에 대한 해면골 반응을 조사하기 위해 설계되었으며 PTOA 연구 2,3,4,5,6을 위한 비수술적 동물 모델로 수정되었습니다. 이론적 근거는 주기적인 외력을 가하여 관절 연골을 충돌시켜 일련의 염증 반응을 유발하는 것입니다. 그러나이 모델은 마우스에만 적용되었으며 더 큰 동물에 대한 적절한 하중 크기는 논의되지 않았습니다.

이전 모델의 또 다른 문제점은 대용량 프로토콜이 너무 많은 사이클을 포함하여,여러 샘플에서 원치 않는 부작용인 연골하 뼈의 과도한 비후를 유발한다는 것이다7. 따라서, 큰 동물에 대해 적절한 크기와 더 낮은 로딩 부작용을 갖는 주기적 압축의 새로운 방법이 개발되었다8. 현재 기사의 전반적인 목표는 쥐에서 비침습적 순환 압축 모델의 프로토콜을 설명하고 연골 변성의 대표적인 결과를 관찰하는 것입니다. 현재 프로토콜은 쥐에 대한 비 침습적 순환 압축 모델의 적용에 관심이있는 독자를 도울 것입니다.

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Protocol

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이 프로토콜은 교토 대학 동물 연구위원회 (승인 번호 : Med kyo 17616)의 승인을 받았습니다.

1. 쥐 무릎에 생체 내 순환 압박 수행

  1. 실험동물 마취 유도
    1. 12주령의 Wistar 랫트(256.8 ± 8.7 g)를 마취 박스에 5% 이소플루란 용액을 흡입하여 마취를 유도하였다.
    2. 메데토미딘, 미다졸람, 부토르파놀을 포함한 3가지 마취제9의 혼합물을 쥐 체중 2mg/kg에 복강 주사하고 오른쪽 무릎 관절 주변을 면도합니다. 발가락 꼬집음에 대한 페달 반사가 부족하여 충분한 마취를 확인하십시오.
  2. 마취 된 쥐를 고정 장치에 장착하십시오.
    1. 마취된 쥐를 베이스 플레이트(그림 1)의 배에 놓고 오른쪽 무릎을 오목한 홈이 있는 작은 수지 조각에 부착합니다. 오른쪽 뒷다리를 고관절 확장, 무릎 굴곡 및 발목 확장 위치에 놓고 무릎을 약 140° 구부립니다. 움직일 수있는 고정 장치의 쐐기 모양의 홈에 쥐의 발 뒤꿈치를 수용하십시오.
    2. 고정 장치를 응력/인장 시험 기기로 옮깁니다( 재료 표 참조). 로드셀과의 접촉이 없는지 확인한 후 응력/인장 시험 기기 제어 소프트웨어(재료 표)를 열고 교정 버튼을 클릭합니다. 교정 후 프레임 상단을로드 셀에 조심스럽게 부착하십시오. 무릎 관절을 프레임에 밀접하게 부착하려면 예압이 5N에 도달할 때까지 이동식 주 작동 패널의 회전 손잡이를 천천히 켭니다.
  3. 로딩 방법을 빌드하고 압축 테스트를 설정합니다.
    1. 주 메뉴에서 새 메서드 만들기를 클릭합니다| 시스템 레이블. 테스트 모드를 주기로 설정하고 테스트 유형을 압축으로 설정합니다. 센서 레이블을 클릭하고 테스트 탭을 선택하여 한계가 60N 이내인지 확인합니다. 또한 스트로크 탭을 선택하고 한계가 500mm 이내인지 확인합니다.
      알림: 위의 단계는 응력 지점에 큰 변위가 있는 경우 즉시 작동을 중지합니다.
    2. 테스트 컨트롤 레이블 아래에서 성장 기원을 선택하여 0.3%/전체 배율로 기본 프로그램을 시작합니다. 로딩 사이클의 4개 섹션 중 1번째 및 3번째 섹션에서 제어되는 스트로크 속도를 1mm/s로 설정합니다. 2번째 섹션의 최대 테스트 힘을 20N으로 설정하고 4번째 섹션의 최소 테스트 힘을 5N으로 설정합니다. "유지 지속 시간"을 피크 부하의 경우 0.5초, 최소 부하의 경우 10초로 설정합니다(그림 2).
      알림: 이 단계는 모든 사이클을 정의하므로 조인트 표면이 서로 접촉하고 적절한 속도로 움직이며 동작이 유지되는지 확인하십시오.
    3. 페이지 하단의 사전 로드 탭에서 On 이 선택되어 있고 처짐 제거 속도가 100mm/min으로 설정되어 있으며 최대 힘이 5N인지 확인합니다. 시편 레이블에서 재질 을 금속으로 설정합니다.
      참고: 이러한 세부 설정은 각 제조업체에 따라 다를 수 있습니다.
    4. 주 메뉴의 메서드 및 테스트 선택 섹션에서 방금 빌드한 메서드를 선택하고 시작을 클릭하여 테스트를 시작합니다.
      알림: 하단의 표는 피크 하중 및 변위의 실제 측정값을 보여줍니다.
    5. 주기 수를 60으로 설정합니다.
      참고: 전체 로딩 세션에는 약 12분 동안 지속되는 60개의 사이클이 포함됩니다. 대조군에서, 랫트는 동일한 조건 하에서 12분 예비로딩 동안 5N 예비로딩을 받았다.
  4. 적재 후 쥐를 새장으로 돌려 보내고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 케이지에서 12-12 시간의 밝은 어두운 일정을 유지하여 충분한 공간과 음식을 자유롭게 유지하십시오 . 필요한 실험 기간 후에, 분석을 위해 복강 내 주사 또는 이산화탄소 흡입 (1 h-8 주)에 주사 된 3 개의 마취제 혼합물의 과다 복용으로 랫트를 희생시킨다.

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Results

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20 N 순환 로딩을 실시한 샘플에서 연골세포 생존율의 단기 변화(1시간 및 12시간)의 대표적인 결과가 얻어졌다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 죽은 연골 세포의 수 (적색 형광)는 외상 후 12 시간에 증가했습니다. 반대로, 살아있는 연골 세포의 수 (녹색 형광)는 계속 감소했으며, 일부 샘플에는 감염된 부위에 살아있는 연골 세포가 포함되어 있지 않았습니다.

조직학은 20N 동적 로딩을받은 쥐 무릎의 관절 연골이 손상되었음을 보여 주었고, 모든 샘플에서 외측 대퇴 과두에서 하나의 국소 병변 영역이 확인되었습니다 (그림 4). 그러나 병변 크기는 8 주 관찰 기간 동안 점진적으로 증가하지 않았습니다. 병변과 영향을받지 않은 연골의 계면에 해당하는 경계가 감염된 부위에서 관찰 될 수 있습니다.

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Discussion

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처음으로, 현재 프로토콜은 마우스2와 같은 더 작은 설치류에서의 관절 내 손상 모델과 유사하게 쥐의 외측 대퇴 과두에 로딩 유도 연골 병변의 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. 그러나 마우스의 로딩 프로토콜은 심각한 골괴사 형성 및 십자 인대 병변을 유발하여 주기적 압축의 효과를 평가하는 데 이상적이지 않았습니다. 현재의 프로토콜은 훨씬 낮은 로딩 포스를 가진 쥐에서 국소 연골 병변을 생성했습니다. 적절한 크기, 속도 및 스트레스 지속 시간만이 뼈 조직을 손상시키지 않고 연골을 파괴할 수 있기 때문에 올바른 로딩 방법 설정은 프로토콜에 매우 중요합니다.

변위 한계 설정 (프로토콜 단계 1.3.1)은 인대 파열시 또는 쥐가 로딩 세션 중에 마취에서 깨어난 경우 즉시 기기를 중지하기 때문에 중요합니다. 최적의 최대 하중과 쥐의 나이는 아직 결정되지 않았습니다. 그러나 예비 실험에서 50N 이상의 하중은 쥐의 무릎에서 ACL 파열 가능성이 높...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 JSPS KAKENHI 보조금 (번호 JP18H03129 및 JP18K19739)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
이 연구는 또한 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NICHD), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS) 및 국립 보건원 (NIBIB)의 지원을받는 재생 재활 연구 및 훈련 연합 (AR3T)의 자금 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
소동물용 마취기구SHINANO MFG CO.,LTD.SN-487-0T
자필 서명 AG-XShimadzu CorpN.A.정밀 범용 / 인장 시험기
Fluoview FV10i 현미경Olympus CorpN.A.완전 자동화된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
ISOFLURANE 흡입 솔루션, Pfizer Japan Inc.(01)14987114133400
LIVE/DEA 생존력/세포독성 키트Thermo Fisher Scientific Japan IncL3224세포의 생존력을 결정하기 위한 빠르고 쉬운 2색 분석
TRAPEZIUM X SoftwareShimadzu CorpN.A.Autograph AG-X용 데이터 처리 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
  2. Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
  3. Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
  4. Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
  5. Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
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  8. Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
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