당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
1차 섬모(PC)는 대부분의 포유류 세포의 표면에서 튀어나온 비운동적 동적 마이크로투룰계 세포기관이다. 그(것)들은 세포 주기의 G1/G0 단계 도중 오래된 중심에서 나타나고, 세포가 G2/M 상 경계에서 세포 주기를 다시 입력할 때 분해하는 동안. 그들은 많은 세포 프로세스에 중요한 세포 외 신호를 감지하고 변환하여 신호 허브로 작동합니다. 대부분의 세포 유형과 유사하게, 모든 신코르티칼 신경줄기 및 전구 세포(NSPC)는 정상 뇌피질 발달에 필요한 특정 신호를 감지하고 변환할 수 있도록 PC를 수용하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 신피성 발달 시 PC의 참여를 더욱 해부하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(hIPSC)로부터 2차원(2D) 및 3차원(3D) 세포 기반 모델을 생성하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히 소닉 고슴도치(SHH) 경로의 트랜스듀션을 포함한 2D 신경 로제트 유래 NSPC에서 PC 생체 발생 및 기능을 연구하는 프로토콜을 제시합니다. 대뇌 오르가노이드의 3차원(3D) 조직을 활용하기 위해 토토 면역스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 광학 클리어링 후, 전체 오르가노이드를 빠르게 획득하면 전체 오르가노이드의 신코르테컬 전구및 뉴런에서 센트로좀과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 3D 공간 정보의 상당한 정도를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 질적 및 정량적 분석에 필요한 고해상도 획득을 허용하는 두꺼운 자유 부동 오르가노이드 섹션의 면역 염색 및 청산 절차를 자세히 설명합니다.
서론
1차 섬모(PC)는 세포외 환경에서 과다한 화학 및 기계적 단서를 감지하고 트랜스포우하는 마이크로투벨계 세포기관입니다. 특히, PC는 척추동물에서 고슴도치 신호 경로의 침투를 위한 중앙 세포기관이다1,2. 대부분의 신경 세포는 오랫동안 PC를 품고 있는 것으로 나타났지만, 중추 신경계를 형성하는 이 세포기관의 기여는 오랫동안 저평가되어 왔습니다. 신구체 발달에 대한 연구는 여러 신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)의 발견으로 이어졌으며, 모두 PC를 수용하고 있으며, 그 위치는 선조 운명 결정에 매우 중요하다고 제안되었습니다3,4,5,6,7. PC는 NSPC 확장 및 약정 8,9,10,11,12뿐만 아니라 신경 마이그레이션을 지원하는 방사형 신경교질 비계의 apicobasal 극성을 포함하여 정상적인....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 신피성 발달의 2D hIPS 세포 기반 모델의 생성
- 신경 로제트 형성
- 큰 일반 식민지를 품고 있는 hIPSC 문화로 시작하여 10% 미만의 차별화와 80% 이상의 인플루엔자를 전시합니다.
- PBS2mL로 hIPSC를 헹구세요.
- 바위 억제제 (NIM + Y-27632의 10 μM)로 보충 된 NSPC 유도 매체2 mL을 추가합니다.
- 바늘을 사용하여 각 hIPSC 콜로니를 35mm 접시에서 수동으로 해부하여 각 식민지를 수평 및 수직 방향으로 정확하게 절단하여 각 식민지를 동일한 클러스터로 나누는 체커 보드 패턴을 만듭니다.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 식민지를 분리하고 초저 부착 35mm 접시에 옮겨 넣습니다.
- 배아 체(EBs)를 형성할 수 있도록 37°C 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 떠있게 하십시오.
참고: 배아 체(EB)는 부동 스페로이드 클러스터 또는 hIPSC의 집합체로 정의됩니다. - 2mL NIM + Y-27632의 10 μM에서 폴리 L-ornithine/laminin(PO/laminin)으로 EB를 전송합니다. ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
2D hIPS 세포 기반 모델은 1 차 적인 실륨 생물 발생 및 기능을 연구합니다
여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 발표된 연구에서 20,21,22로 조정되었습니다. 이 프로토콜은 개발 신피질에서 보인 것과 유사한 신피성 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 특정 제조자를 이용한 종래의 면역염색 분석에 의해 수행될 수 있다3. 예를 들어, apical 전구체(AP)는 SOX2 및 PAX6로 이중 염색되어야 하며, 중간 전구(IP)는 TBR2/EOMES 염색에 의해 드러나며, 초기 태어난 신코르티컬 뉴런은 CTIP2 염색(그림 1A-C
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
PC는 이제 NSPC 확장 및 약정을 포함하여 정상 뇌 피질 발달 18,19,31 동안 중요한 단계를 조절하는 주요 세포 기관으로 간주됩니다18,9,10,11,12뿐만 아니라 뉴런 마이그레이션13,14 및 시냅토발생16,17 . 동물 모델 이나 인간 태아 뇌 조직에서.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 S.T.(ANR-17-CE16-0003-01) 및 N.B.B.(ANR-16-CE16-0011 및 ANR-19-CE16-0002-01)에 대한 국가 국립 기관 드 라 레체쉬(ANR)의 보조금에 의해 지원되었습니다. LB는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01)과 베텐코트 슈엘러 (MD-PhD 프로그램)에서 ANR에 의해 지원됩니다. 이매진 연구소는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01, CrossLab 프로젝트)에 따라 ANR의 국가 자금 지원및 두 번째 인베스트먼트 d'Avenir 프로그램 (ANR-17-RHUS-0002)의 일환으로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토&이아큐트; 타놀 (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment | Microplate Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), 무혈청 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere 희석 완충액 | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF, 25&마이크로; g | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2, 25µ g | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| 녹아웃 세럼 | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel 성장 인자 감소 | Corning | 354230 | |
| MEM 비필수 아미노산 용액(100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| 신경 기저 매체 | Thermofischer | 21103049 | |
| 오비탈 쉐이커 | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | 전자 현미경 과학 | 15714 | |
| 폴리-L-오르니틴(PO) | Sigma | P4957 | |
| 재조합 인간 BDNF 10 &마이크로; g | 줄기 세포 기술 | 78005 | |
| 재조합 인간 FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R & D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| 스템비즈 FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| 설탕 | 그마 Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus 접착 슬라이드 | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| 공급&이큐트; 멘트 N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2'-티오디에탄올 | 시그마 알드리치 | 166782-500G | |
| 비트로넥틴 | 스템셀 테크놀로지 | 7180 | |
| Y-27632 | 스템셀 테크놀로지 | 72304 | |
| <강력한>일차 항체 | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R& D 시스템 | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD 형질전환 연구소 | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R& D 시스템 | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γ TUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| 염소 안티-마우스 AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| 염소 안티-마우스 AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500E |
| 염소 안티 랫트 AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
참고문헌
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
