단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 티올에 대한 가역적 산화 변형은 최근 세포 기능의 중요한 매개체로 부상했습니다. 여기에서는 탠덤 질량 태그(TMT) 등압 라벨링 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)과 함께 수지 보조 포획(RAC)을 활용하여 프로테옴 수준에서 산화된 단백질 티올의 멀티플렉스 스토키오메트릭 정량화를 허용하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 자세한 절차를 설명합니다. 산화된 시스테인 잔기에 대한 부위별 정량적 정보는 이러한 변형의 기능적 영향에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다.
워크플로우는 배양된 세포(예: 포유류, 원핵생물) 및 전체 조직(예: 심장, 폐, 근육)을 포함한 많은 샘플 유형에 적용할 수 있으며, 이는 초기에 용해/균질화되고 인공 산화를 방지하기 위해 유리 티올이 알킬화됩니다. 산화된 단백질 티올은 티올 친화성 수지에 의해 환원 및 포획되며, 이는 단백질/펩타이드의 추가 전달 없이 진행된 소화, 라벨링 및 세척 절차를 수행할 수 있도록 하여 워크플로우 단계를 간소화하고 단순화합니다. 마지막으로, 표지된 펩타이드를 LC-MS/MS에 의해 용리 및 분석하여 전체 프로테옴에서 티올 산화와 관련된 포괄적인 화학량론적 변화를 나타냅니다. 이 방법은 단백질 티올 산화와 관련된 생리적 및 병리 생리 학적 상태 하에서 산화 환원 의존성 조절의 역할에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.
서론
항상성 조건에서 세포는 대사 및 신호 전달 1,2,3과 같은 과정을 촉진하는 데 도움이 되는 반응성 산소, 질소 또는 황 종을 생성하여 원핵생물과 진핵생물 모두로 확장됩니다. 이러한 반응성 종의 생리학적 수준은 'eustress'라고도 하는 적절한 세포 기능에 필요합니다.1,4. 대조적으로, 산화제와 항산화제 사이의 불균형으로 이어지는 산화제의 증가는 산화 스트레스 또는 '고통'1을 유발하여 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 산화제는 단백질, DNA, RNA 및 지질을 포함한 다양한 생체 분자를 변형시켜 신호를 생물학적 경로로 변환합니다. 특히, 단백질의 시스테인 잔기는 시스테인 상의 티올기로 인해 산화되기 쉬운 반응성이 높은 부위이며, 이는 상이한 유형의산화제에 대해 반응성이다5. 이는 니트로실화(SNO), 글루타티오닐화(SSG), 술페닐화(SOH), 과황화(SSH), 다황화(SSNH),아실화 및 이황화물을 포함하여 ....
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프로토콜
동물 또는 인간 샘플 / 조직과 관련된 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 인간 및 동물 연구 윤리위원회의 기관 지침에 의해 승인되고 준수되었습니다.
1. 시료 균질화/용해
- 냉동 조직 샘플
- 냉동 조직 (~ 30mg)을 유리 현미경으로 다진 후 미리 냉각 된 면도날과 집게를 사용하여 드라이 아이스 슬라이드에 놓습니다. 다진 조직을 700μL의 완충액 A( 표 1 참조)가 포함된 냉각된 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 옮기고 빛으로부터 보호하면서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
- 30초 동안 또는 휴대용 조직 균질화기로 완전히 균질화될 때까지 조직을 파쇄합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 거품이 10분 더 가라앉도록 합니다.
알림: 드라이 아이스 위에 놓인 알루미늄 베이킹 시트는 조직의 초기 처리 / 분쇄를위한 안정적인 작업 표면과 플랫폼을 제공합니다.
- 또는 100mm 배양 접시의 부착성 세포 배양을 출발 물질로 사용하십시오.
- 세포를 얼음 위에 유지하고 혈청학적 피펫을 사용하여 100mM NEM을 함유한 10mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.
- 차가운 균질화/용해 완충액 ....
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결과
프로토콜의 완료는 종종 >95% 특이성 27,35,36을 갖는 이전에 산화된 시스테인-함유 펩티드의 고도로 특이적인 농축을 초래할 것이다. 그러나, 프로토콜의 몇몇 주요 단계들은 특별한 주의를 필요로 하는데, 예를 들어, 인위적으로 산화된 티올(25)의 인공 산화 및 비특이적 농축을 금지하는 샘플 용해/균질화 전에 유리 티올의 초기 차단이 필요하다. 샘플은 프로토콜의 여러 단계에서 그리고 단백질 및 펩티드 모두의 SDS-PAGE 분석을 포함하는 상이한 방법에 의해 분석될 수 있다. SDS-PAGE는 총 티올 샘플이 처리 / 자극으로 인한 다양한 산화 수준을 결정하기 위해 샘플 간의 비율 메트릭 비교를 가능하게하는 샘플의 정성 분석을 가능하게합니다 (그림 2A). .......
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토론
수지 보조 포획은 시스테인 잔기25,29,30의 산화 변형을 조사하기 위해 다양한 샘플 유형 및 생물학적 시스템에 걸쳐 활용되었습니다. 이 방법을 사용하면 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 사용한 단백질 및 펩타이드뿐만 아니라 질량 분석법을 사용하는 개별 시스테인 부위를 포함한 여러 수준 및 판독 값에서 샘플을 평가할 수 있습니다. 샘플 유형 또는 최종 종점에 관계없이, 상기 방법은 궁극적으로 시스테인-함유 단백질 및 펩티드38의 매우 효율적이고 특이적인 농축을 허용한다. RAC를 사용하여 섭동 후 다양한 모델 시스템에서 최대 수천 개의 시스테인 부위의 산화 상태 변화를 확인했습니다.
피로한 근육 수축을 받은 마우스에서 2,200개의 S-글루타티오닐화.......
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공개 사항
저자는 재정적 또는 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
작업의 일부는 NIH 보조금 R01 DK122160, R01 HL139335 및 U24 DK112349의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | 사내 수지 합성용 시약 |
| 2.0 mL LoBind 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL 원형 바닥 튜브 | Falcon | 352054 | |
| Acetone Fisher Scientific | A949-1 | ||
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| 활성 티올– 세파라스 4B | Sigma Aldrich | T8512 | 티올 친화성 수지의 잠재적 대체 |
| Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터 | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | 단백질 분석 시약 |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-에틸말레이미드 | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | 사내 수지 합성용 시약 |
| QIAvac 24 Plus 진공 매니폴드 | Qiagen | 19413 | |
| 염화나트륨 | Sigma Aldrich | S3014 | |
| 도데실황산나트륨(SDS) | 시그마 Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| 스핀 컬럼 | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E 역상 컬럼 | Phenomenex | 8B-S001-DAK | 펩타이드 탈염 |
| 써모믹서 | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | 티올 친화성 수지; *Thiopropyl Sepharose 6B 수지의 생산은 제조업체에 의해 중단되었습니다(자세한 내용은 프로토콜 참조). |
| TMT 등원소 라벨(16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | 펩타이드 라벨링 시약, 다양한 형식으로 사용 가능 |
| 트리에틸암모늄 바이카보네이트 버퍼(TEAB)시 | 그마 알드리치 | T7408 | |
| 트리플루오로아세트산(TFA) | 시그마 알드리치 | T6508 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 알드리치 | T8787 | |
| 트립신 | 프로메가 | V5820 | |
| 우레아 | 시그마 Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | 진공 농축기 |
| Vortex 믹서 | 과학 산업 | SI-0236 |
참고문헌
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular s....
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