방법 논문

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

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DOI:

10.3791/62672

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2021년 6월 8일

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.

초록

용액 중에 공존하는 다중 단백질 상태의 형태적 이질성을 해결하는 것은 단백질 치료제의 특성화와 분자 인식에서 효소적 촉매에 이르기까지 생물학적 기능에 중요한 형태적 전이 경로의 결정에서 주요 장애물 중 하나로 남아 있다. 하향식 질량 분광법(MS) 분석과 결합된 수소/중수소 교환(HDX) 반응은 단백질 고차 구조 및 역학을 순응자 특유의 방식으로 특성화하는 수단을 제공합니다. 이 기술의 형태적 분해능은 무손상 단백질 수준에서 단백질 상태를 분리하고 HDX 반응 동안 잔류 비중수소화 양성자성 함량을 최소화하는 효율성에 크게 의존합니다.

여기서는 형태 분해능을 향상시키는 것을 목표로 하는 HDX MS 접근법의 모세관 전기영동(CE) 기반 변이체를 설명한다. 이 접근법에서, 단백질은 모세관 전기영동 분리 동안 중수소화된 배경 전해질 용액(BGE)을 통해 이동하면서 HDX 반응을 겪는다. 용액 중에 공존하는 상이한 단백질 상태 또는 프로테오폼은 이들의 상이한 전하 대 크기 비율에 기초하여 효율적으로 분리될 수 있다. 단백질과 양성자성 용매 분자 사이의 전기영동 이동성의 차이는 잔류 비중수소화 용매를 최소화하여 HDX 공정 중에 거의 완전한 중수소화 환경을 초래합니다. 유동-관통 마이크로바이알 CE-MS 계면은 분무기의 출구에서 담금질 및 변성 개질제 용액과의 신속한 혼합에 이어 용출된 단백질 종의 효율적인 전기 분무 이온화를 허용한다. 온라인 하향식 MS 분석은 용출된 무손상 단백질 종의 글로벌 중수소 수준을 측정하고, 그 후 기상 단편의 중수소화를 측정합니다. 이 논문은 우유에 공존하는 천연 단백질 변이체를 포함한 시스템에 대한 차등 HDX에서 이러한 접근법을 보여줍니다.

서론

서로 다른 형태적, 결합 또는 변형 상태에서 단백질 종을 구별하고 구조적 차이를 특성화하는 것은 분자 인식에서 효소 촉매에 이르기까지 생물학적 사건에 관여하는 이들 종 간의 전이 경로를 모니터링하고 이러한 사건의 기초가되는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 종래의 생물물리학적 기술은 용액 중의 불충분한 분해능 및 동적 정보의 손실과 같은 한계로 인해 완전한 해결책을 제공하지 못한다. 질량 분광법 (HDX MS)과 결합 된 수소 / 중수소 교환은 단백질의 불안정한 수소 원자와 의도적으로 도입 된 2H2O용액의 2H 사이의 교환을 통해 중수소 (2H)로 단백질의 구조적 및 형태적 특징을 표시하는 기술입니다. 수소 결합에 관여하거나 단백질 내부의 용매로부터 격리되는 양성자는 쉽게 교환되지 않는다1. 따라서, 교환 가능한 부위에서의 환율이 고차 구조에서의 그의 관여에 크게 의존함에 따라, 단백질 구조는 1H와 2H 사이의 상이한 원자 질량에 기초하여 2H-흡수의 범위와 속도를조사하는 MS에 의해 높은 공간 분해능에서 드러날 수 있다. 최근 수십 년 동안 HDX MS는 단백질 형태 및 역학2를 연구하는 데 매우 성공적인 기술이되었습니다.

HDX MS의 고전적인 상향식 접근법에서, 상이한 형태적, 결합 또는 변형 상태에 있는 단백질 종의 앙상블은 손상되지 않은 단백질 수준에서 분리되지 않고 단백질 분해되어, 생성된 단백질 분해 단편을 복잡한 중수소 내용물로 분석함으로써 개별 종을 특성화하는 것을 불가능하게 만든다. 대조적으로, 하향식 접근법에서, 상이한 중수소 내용물을 혼입시킨 상이한 단백질 상태 또는 프로테오폼은 MS 스캔에서 무손상 단백질 질량의 다중 분포를 야기한다. 이것은 개별 종들이 적절한 질량 필터 (예 : 사중극자)를 사용하여 각 질량 분포에 상응하는 이온의 질량 선택과 후속 탠덤 MS 분석3,4,5,6에서 그들의 형태 차이의 특성화에 의해 분리 될 수있게한다. 그러나, 이 전략에서 단백질 상태 또는 프로테오폼을 분리하는 효율은 그들의 상응하는 질량 분포에서의 차이의 정도에 의해 제한된다.

모세관 전기영동(CE)은 용액 상에서 그들의 상이한 전하 및 유체역학적 크기에 기초하여 단백질 종을 고효율로 분리하는 수단(7)을 제공한다. CE와 HDX를 결합하면 용액 단계에서 단백질 상태 또는 단백질 형태를 추가로 분리할 수 있습니다. 또한, CE 모세관의 작은 부피는 배경 전해질 용액 (BGE), 즉 실행 버퍼로서 완전히 중수소화 된 용액의 활용을 허용하여 모세관을 단백질 샘플을위한 HDX 반응기로 렌더링합니다. 전기영동 과정에서 단백질과 양성자성 시약 사이의 전기영동 이동성의 차이로 인해, CE 동안 HDX를 수행하면 잔류하지 않은 내용물로 단백질 분석물에 대해 거의 완전한 중수소화 환경이 조성되어 HDX 데이터를 사용한 구조 분석의 민감도가 향상됩니다. 이와 같이, 우리는 상태 또는 프로테오폼 특이적 방식으로 단백질 고차 구조를 특성화하기 위해 하향식 MS와 결합된 CE 기반 차등 HDX 접근법을 개발하였다8.

이 백서에서는 재료 준비, 실험 절차 및 데이터 분석 단계를 자세히 설명하여이 접근법에 대한 프로토콜을 설명합니다. 메서드 성능 또는 데이터 품질에 영향을 줄 수 있는 요소는 간단한 메모에 나열되어 있습니다. 여기에 제시된 대표적인 결과는 우유9에 존재하는 주요 유청 단백질인 소 β-락토글로불린(β-lg)의 상이한 단백질과 천연 변이체의 혼합물의 차등 HDX 데이터를 포함한다. 우리는 CE 기반 HDX 및 그 형태에 대한 변형 특이적 특성화 동안 β-lg의 두 가지 풍부한 변형, 즉 A 및 B10,11의 분리 효율, 재현성 및 2H라벨링 성능을 입증합니다.

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프로토콜

참고: MS 분석을 방해할 수 있는 오염 물질을 최소화하기 위해 가능하면 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급 또는 MS 등급 시약을 사용하십시오. 전기 영동 전압 또는 전기 분무 전압으로 인한 감전의 가능성을 피하기 위해 측정 중에 맨손으로 CE-MS 인터페이스를 만지지 마십시오.

1. 재료 준비

  1. CE를 위한 용융 실리카 모세관의 변형
    1. HPC 분말(분자량 [MW]: 100 kDa)을 물에 용해시키고 실온에서 ~12시간 동안 연속 교반하면서 또는 고체 입자(12)가 완전히 사라질 때까지 5%(w/w) 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC) 용액을 준비한다. 초음파로 눈에 보이는 기포를 제거하십시오.
    2. 약 85 cm 길이의 용융 실리카 유리 모세관(내경 [ID]: 50 μm, 외경 [OD]: 360 μm)을 CE 장비에 장착한다. 아세톤 13과 같은 유기 용매를 연속적으로 주입하고, CE의 자동 시료 주입기를 사용하여40 psi의 주입 압력에서 10-15분 동안 모세관을 헹구십시오.
    3. 40 psi의 주입 압력 (종종 ~ 40 분이 소요됨)에서 자동 시료 주입기를 사용하여 세척 된 모세관을 HPC 용액으로 채 웁니다. HPC로 채워진 모세관에 40psi로 공기를 주입하여 물에 담글 때 모세관에서 분출된 기포로 표시된 모세관 내의 자유로운 공기 흐름을 보장합니다.
    4. HPC 코팅 모세관을 온도 프로그래밍 가능 오븐(이상적으로는 온도 프로그래밍된 가스 크로마토그래프의 온도 제어 컬럼 오븐)에서 모세관을 통해 흐르는 질소 가스(25 psi)로 구워서 그림 1에 표시된 온도 프로그램에 따라 구우십시오.
    5. 모세관을 꺼내기 전에 오븐을 실온으로 식히십시오. CE 분리를 위해 HPC 변형된 모세관을 사용하십시오.

figure-protocol-1
그림 1: 모세관 베이킹에 권장되는 온도 프로그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 배경 전해질(BGE) 용액 및 개질제 용액8
    1. 적절한 양의 아세트산암모늄을 2H2O. BGE의분취량 200 μL에 용해시켜 원하는 농도(예를 들어, 10 mM)로 BGE를 1-10 mL로 제조하고, 공기 중의 BGE와 수증기 사이의 HDX 반응을 최소화하기 위해 바이알을 파라필름으로 밀봉한다.
    2. 개질제 용액 10 mL를 75% (v/v) 메탄올과 25% (v/v) 물로 준비하고, pH는 포름산을 사용하여 2.5로 조정하였다.
      참고: MS에 의한 검출을 위해 측쇄 및 보호되지 않은 골격 아미드의 중수소 원자가 유지되어야 하는 경우2H2O및 중수소화 메탄올을 사용하여 개질제 용액을 준비하십시오.
  2. 단백질 샘플의 탈염
    1. 원하는 농도로 중수소화되지 않은 물에 암모늄 아세테이트 용액을 준비하십시오.
      참고: 전기영동 중 높은 전류와 그에 따른 줄 가열 효과를 피하기 위해 100mM 미만의 농도를 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 필요한 경우 아세트산암모늄 용액의 pH를 포름산(pH < 6.8) 또는 수산화암모늄(pH > 6.8)을 사용하여 원하는 수준으로 조정한다.
    3. 단백질 용액의 원래 완충액을 적절한 MW 컷오프가 있는 원심 필터를 사용하여 4°C에서 적어도 5개의 순차적 농도 및 희석 단계를 통해 암모늄 아세테이트 용액(원하는 농도의 중수소화되지 않은 물에서 제조; 수산화암모늄으로 pH가 7.5로 조정됨)으로 대체한다.
      참고: 탈염될 단백질 샘플은 사전 생산 절차(예를 들어, 정제 또는 제형)로부터 또는 단백질의 동결건조된 분말을 용해시켜 제조될 수 있다. 이 단계에서 샘플 용액으로부터 제거되는 "염"은 일반적으로 비휘발성인 모든 작은 이온 또는 분자를 지칭한다. 이러한 종들은 전기영동 과정 동안 단백질로부터 효율적으로 분리될 수 있지만, 이 단계는 전기영동 분해능을 손상시키지 않도록 하여 질량 분광계의 오염을 최소화하는 것이 좋습니다. 단백질 분석물이 특정 염 또는 첨가제에 의해 안정화되어야 할 때, BGE에 포함시킨다.
    4. 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.

2. 세륨 기반 HDX MS 분석의 가동

참고: 이 접근법에 사용되는 질량 분광계에는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR) 또는 오비랩과 같은 초고분해능의 질량 분석기, 단편화를 위한 전구체 이온의 질량 선택을 허용하는 사중극자와 같은 질량 필터, 신뢰할 수 있는 탠덤 MS 데이터(이상적으로 단편 이온의 동위원소 분해 신호)로 하향식 분석을 수행하기 위한 전자 전달 해리(ETD) 또는 전자 포집 해리(ECD) 기능이 장착되어야 합니다.

  1. CE 및 MS 설정 최적화
    1. 금속 코팅된 보로실리케이트 유리 모세관("정적" nanoESI 방식)으로부터 미리 로딩된 샘플을 분무하거나 금속 방출기로부터 연속적으로 주입된 샘플을 분무하여 표준 전기분무 이온화(ESI) 소스를 사용하여 파일럿 MS 측정을 수행하여 무손상 단백질(MS1) 및 이들의 기상 단편(MS2)의 측정을 위한 MS 설정을 최적화합니다. 단일 전하 상태에서 그의 이온의 앙상블을 질량 선택함으로써 관심있는 단백질 종을 단편화하고, 전구체 이온의 ETD 또는 ECD를 포함한다.
      참고: 필수 설정에는 용해에 영향을 미치는 매개 변수, 전구체 이온의 질량 선택(다른 종의 간섭을 피하기 위해) 및 단편화 효율성이 포함됩니다. 질량 선택 창의 중심과 너비는 모두 HDX 후 분석물 이온의 결과 질량 분포와 일치하도록 증가되어야 합니다. CE에서 단백질 종의 용출 윈도우는 전형적으로 0.5분 내지 2분의 범위이기 때문에, 비교가능한 시간 윈도우에 걸쳐 축적된 MS2 스캔에 기초하여 단편화 효율을 평가한다. 이러한 파라미터의 최적 값은 단백질 특이적이며; 독자는 예시적인 설정들(8,14)에 대해 이전에 공개된 보고서들을 참조한다.
    2. 광 검출기, 즉 광 다이오드 어레이 (PDA) 검출기 또는 UV 검출기가 장착 된 CE 기기를 사용하여 파일럿 CE 측정을 수행하여 HDX 반응 시간과 동등한 단백질 종의 분리 및 이동 시간에 대한 CE 설정을 최적화하십시오.
      참고: 이 단계는 CE의 광학 검출기의 가용성에 따라 선택 사항입니다. 광 검출기가 없는 경우, 섹션 2.3에 설명된 지침에 따라 섹션 2.2의 완료 시 CE-MS를 사용하여 CE 설정을 최적화할 수 있습니다. 필수 설정에는 분리 효율에 영향을 주는 파라미터, 일렉트로페로그램에 표시된 피크 모양 및 용출 시간이 포함됩니다.
  2. CE-HDX 설정의 사전 조정
    1. 실온에서 적어도 30분 동안 초음파화를 사용하여 50% 메탄올, 49% 물 및 1% 포름산(v/v)의 혼합물로 유동 관통 마이크로바이알 CE-MS 계면을 청소하십시오.
    2. HPC 변형된 모세관을 CE 장비에 장착한 후, 10분 동안 자동 시료 주입기를 사용하여 모세관을 BGE로 헹구고 모세관을 BGE로 채워 둡니다.
    3. 개질되지 않은 용융 실리카 모세관 튜빙의 적절한 길이(ID: 50 μm, OD: 360 μm)를 개질제 용액용 주입 튜빙으로서 수득한다. 개질제 튜빙을 유니온과 적절한 슬리브를 사용하여 무딘 팁으로 가스 밀폐 유리 주사기에 연결하고 주입 펌프를 사용하여 개질제 용액으로 튜브를 헹구십시오 적어도 10 분 동안.
    4. 그림 2와 같이 해당 용액이 로드된 HPC 코팅된 CE 모세관 및 개질제 튜브의 콘센트를 세척된 CE-MS 인터페이스에 삽입합니다.
    5. 개질제 주입을 위한 주사기를 수동으로 또는 주입 펌프와 함께 진행하여 개질제 용액이 인터페이스의 팁에 도달하도록 하십시오. 조립된 CE-MS 인터페이스를 질량 분석기의 nanoESI 소스 하우징에 장착합니다.

figure-protocol-2
그림 2: CE 기반 HDX MS 설정의 개략적인 그림. 이 수치는8에서 수정되었습니다. 약어: BGE = 배경 전해질 용액; CE = 모세관 전기영동; MS = 질량 분광법; HDX = 수소/중수소 교환; ESI = 전기 분무 이온화; FTICR = 푸리에-변환 이온 사이클로트론 공명; ETD = 전자-전달 해리; ECD = 전자 포획 해리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 동시 CE 분리, HDX 반응 및 MS 분석
    참고: 중수소화 BGE는 밀봉 해제 후 1일 이내에 사용하는 것이 좋습니다.
    1. CE-MS 인터페이스에 3-5kV의 스프레이 전압을 적용합니다.
    2. 개질제 용액을 0.1 ~ 10 μL/min 범위의 유속으로 주입 펌프에 주입하기 시작하고 CE-MS 인터페이스의 팁에서 안정적인 전기 분무를 보장하십시오.
    3. BGE를 함유하는 샘플 바이알을 자동 샘플러에 넣고, 단계 2.3.4에서 이를 사용하여 블랭크 일렉트로페로그램 및 블랭크 질량 스펙트럼을 획득한다.
    4. 샘플 용액을 2 psi에서 자동 시료 주입기를 사용하여 주입하고 원하는 양의 시료를 주입 할 수 있도록 적절한 기간 동안 주입하십시오. 수학식 1에 의해 정의된 주입 부피와 주입 파라미터(15)의 관계를 이용하여 주입 부피를 추정한다.
      figure-protocol-3 (1)
      여기서 Vinj는 주입 부피, Δp는 주입 압력, dc는 모세관의 내경, A는 모세관의 단면, tinj는 주입 지속기간, η는 모세관 내의 액체의 점도, L은 모세관의 길이이다.
    5. 30 kV의 전기영동 전압 및 0 내지 2 psi 범위의 주입 압력을 인가함으로써 CE 분리를 시작하고, 일렉트로페로그램을 획득한다. 한편, 이온 전류 그래프가 시간의 함수로서 획득되는 크로마토그래피 모드에서 MS 데이터의 획득을 시작하고, 대응하는 MS 스캔은 단일 스펙트럼으로 자동 결합되지 않는다.
      참고: 단백질은 이 단계에서 전기영동 이동 중에 BGE의2H2O분자와 접촉하는 지점에서 자발적인 HDX 반응을 겪습니다. CE를 위한 광학 검출은 MS 검출 이외에 사용될 수 있다. 컬럼 상의 검출은 용융된 실리카 모세관의 출구 단부에서 특정 길이의 폴리이미드 코팅의 제거를 요구하므로, CE-MS 계면의 조립 동안 모세관 손상을 피하기 위해 추가적인 주의를 기울여야 한다.
    6. 빈 일렉트로페로그램과 질량 스펙트럼을 참조로 저장합니다.
      참고: 빈 데이터는 기준 빼기가 아닌 문제 해결에 사용해야 합니다.
    7. 원하는 농도의 단백질 샘플 용액을 함유하는 샘플 바이알을 자동 샘플러에 넣는다. 단백질 샘플에 대한 일렉트로페로그램 및 질량 스펙트럼을 획득하고, 단계 2.3.4-2.3.5에 따른다. 적절한 수의 MS 스캔을 수집하여 전기영동적으로 분리된 2H표지된 단백질 종의 MS1 스펙트럼을 얻는다.
    8. 동일한 실행 내에서 MS1 스펙트럼을 획득한 후 또는 후속 개별 실행에서 관심 종에 대한 탠덤 MS 측정을 수행합니다.
    9. 필요한 경우 주입 압력 또는 CE 모세관의 길이를 변경하여 이동 시간 / HDX 반응 시간을 조정하십시오. HDX 반응 시간이 이동 시간보다 짧아야 하는 경우, CE 공정 동안 모세관에서 중수소화 및 비중수소화 BGE를 모두사용하는 앞서 설명한 8가지 접근 방식을 사용하십시오.
    10. CE 모세관을 각 측정 후 적어도 10분 동안 20 psi의 압력에서 BGE로 플러시한다.
    11. 실험이 완료되면 CE-MS 인터페이스와 모든 튜브를 청소하여 보관하십시오.
    12. 직접 주입 모드에서 MS와 함께 HDX "종점" 샘플(앞서 설명된6,16 접근법을 사용하여 제조될 수 있음)의 데이터 세트를 획득한다.
      참고: 이 단계는 CE 기반 HDX에 중수소화 수정자 솔루션을 사용하는 경우에만 필요합니다.

3. 데이터 분석

  1. CE 데이터 분석
    1. 다음 플롯 중 하나를 일렉트로페로그램으로 사용하여 피크 수, 마이그레이션 시간 및 분리 효율을 포함한 전기 영동 특성을 결정하십시오 : (a) UV 흡광도 대 마이그레이션 시간, CE 기기의 광학 검출기에 의해 획득 (사용 가능한 경우); (b) MS에 의해 획득된 총 이온 전류(TIC) 그래프; (c) MS에 의해 획득된 추출된 이온 전류(EIC/XIC) 그래프.
      참고: EIC/XIC는 앞서 언급한 일렉트로페로그램 형식 중에서 일반적으로 최적의 신호/잡음비(S/N)를 제공합니다. 도구적 편향이 없더라도 UV 흡광도는 단백질의 질량 농도에 비례하는 반면, MS 신호는 몰 농도에 비례한다는 점은 주목할 만하다. 따라서, CE- 및 MS 유래 일렉트로페로그램 사이의 피크 패턴의 차이를 관찰하는 것이 합리적이다.
    2. 반정량을 위해 일렉트로페로그램에 표시된 피크의 곡선(AUC) 아래의 면적을 사용한다. 단백질 복합체와 관련된 샘플의 경우, 앞서설명한 17 접근법을 사용하여 TIC/EIC 일렉트로페로그램으로부터 질량 농도 데이터를 추론하십시오.
  2. MS 데이터 분석
    1. 각각 상응하는 용출 윈도우 내에서 획득된 MS1 및 MS2 스캔을 조합함으로써 MS1 및 MS2 스펙트럼을 획득한다.
    2. 다음 두 가지 방법 중 하나에 의해 무손상 단백질(M (intact protein)) 및 단편의 질량을 결정한다.
      1. 동위원소 분해된 신호 클러스터를 발생시키는 이온의 평균 질량을 계산한다.
      2. 해당 동위원소 외피6의 피팅으로 인한 가우시안 유사 곡선의 중심을 사용하십시오.
    3. Biopharma Finder, ProSight18 또는 MASH Suite19 와 같은 소프트웨어를 사용하여 단편 이온의 질량 목록을 생성하고 식별하십시오.
  3. HDX 데이터 분석
    1. 수학식 2를 사용하여 무손상 단백질 종의 전체 중수소 수준을 결정한다.
      figure-protocol-4 (2)
      여기서 M(2H) 또는 M(1H)은 2H또는 1H의 원자 중량이다. 별표는 2H표지된 샘플의 데이터를 나타낸다.
    2. 특정 세그먼트의 백본 아미드의 누적 보호 또는 누적 중수소를 결정하십시오.
      1. 중수소화된 수정자 솔루션으로 수집된 데이터의 경우 수식 (3) 및 (4)를 사용하여 누적 보호 수준을 결정합니다.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        여기서 P(Sk(N))는 잔기 1 내지 k에 스패닝하는 N 말단 세그먼트의 총 보호이고, P(Sm(C))는 m 잔기를 포함하는 C 말단 세그먼트의 총 보호이고, M(2H) 또는 M(1H)은 원자 중량이 2H또는 1H이고, M(ci) 또는 M(zi)는ci 또는 zi 이온의 분자량이다.
        참고: 이중 별표는 HDX "끝점" 샘플의 데이터를 나타냅니다.
      2. 중수소화되지 않은 수정자 솔루션으로 수집한 데이터의 경우 방정식 (5) 및 (6)을 사용하여 누적 중수소 수준을 결정합니다.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        여기서 D(Sk(N))는 잔기 1 내지 k를 스패닝하는 N 말단 세그먼트의 누적 중수소 흡수이고; D(Sm(C))는 m 잔기를 포함하는 C 말단 세그먼트의 누적 중수소 흡수이다.
    3. 국소 백본 아미드 그룹에서 중수소 수준을 결정하십시오.
      1. 중수소화된 수정자 솔루션으로 수집된 데이터의 경우 수식 (7), (8), (9), (10) 및 (11)을 사용하여 로컬 보호 수준을 결정합니다.
        C 이온에서 추론 된 데이터
        figure-protocol-9 (7)
        Z-이온으로부터 추론된 데이터의 경우
        figure-protocol-10 (8)
        여기서 P(Ri)는 잔기 i에서 골격 아미드의 보호이고, 하첨자 "전체"는 단백질의 총 잔기 수를 나타낸다.
        후속 단편 이온이 누락된 잔기 부위의 경우, 방정식 (9) 및 (10)을 사용하여 P(Ri)를 할당한다.
        C 이온에서 추론 된 데이터
        figure-protocol-11 (9)
        Z-이온으로부터 추론된 데이터의 경우
        figure-protocol-12 (10)
        이어서, 수학식 11을 사용하여 국소 골격 아미드기에서 중수소 수준 D(Ri)를 결정한다.
        figure-protocol-13(11)
      2. 중수소화되지 않은 수정자 솔루션으로 수집된 데이터의 경우 수식 (12), (13), (14) 및 (15)를 사용하여 로컬 보호 수준을 결정합니다.
        C 이온에서 추론 된 데이터
        figure-protocol-14(12)
        Z-이온으로부터 추론된 데이터의 경우
        figure-protocol-15(13)
        여기서 D(Ri)는 잔기 i에서 골격 아미드의 보호이고, 하첨자 "전체"는 단백질의 총 잔기 수를 나타낸다.
        후속 단편 이온이 누락된 잔기 부위의 경우, 방정식 (14) 및 (15)를 사용하여 D(Ri)를 할당한다.
        C 이온에서 추론 된 데이터
        figure-protocol-16 (14)
        Z-이온으로부터 추론된 데이터의 경우
        figure-protocol-17 (15)

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결과

BGE의 주입 압력을 변경하면 분리 효율과 이동 시간을 모두 조정할 수 있으며, 이는 분리되는 단백질의 HDX 반응 시간과 동일합니다 (그림 3). 주입 압력이 낮을수록 실험 기간의 비용으로 CE 피크가 더 잘 분리됩니다 (그림 3A). 이동/HDX 반응 시간이 길수록 단백질 분석물의 중수소 수준이 높아집니다(그림 3B-D). HDX 시간척도(분)에서 중수소 차이는 주로 빠르게 교환할 수 있는 사이트 대신 구조적으로 보호되는 사이트의 서로 다른 교환 범위를 반영해야 합니다. 두 단백질 종에 의해 보여지는 중수소 시간 기능의 추세에 따르면, 이동 시간 차이는 중수소 차이의 주요 원인이 될 것 같지 않다. 실제로, 홀로- 및 아포미오글로빈(Mb)8의 차등 CE-HDX에서,...

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토론

CE 모세관의 내벽을 코팅하는 목적은 CE 공정13 동안 전기삼투 유동 및 단백질 흡수의 최소화를 포함한다. 전기 삼투 흐름은 중성 또는 반대 하전을 띤 종을 검출기로 구동하는 능력 때문에 소분자의 기존 CE 분석에 유리하지만, 용액에서 유사한 크기와 순 전하를 가진 단백질 종의 분리 효율을 손상시킵니다. 모세관을 HPC로 코팅하면 모세관의 내벽에 있는 실라놀기에 의해 유발되는 전기삼투 유동이 최소화됩니다. 또한, 이러한 실라놀 그룹을 마스킹하면 단백질과의 상호 작용이 줄어들어 모세관 내 단백질의 느린 이동 또는 완전한 보존을 피할 수 있습니다.

전기영동 동안, BGE로부터의 분석물과 양이온 및 음이온 둘 모두는 전기영동 이동을 겪는다. MS와 결합시, CE 모세관의 음전압 측에서 BGE의 저장소는 상이한 조성을 갖는 CE-MS 계면으로 대체된다. 특정 유량으로 양전압 측에서 저장소로부터 모세관에 신선한 BGE를 지속적으로 주입하는 압력...

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공개 사항

D. D. Y. Chen은 Flow-through microvial CE-MS 인터페이스를 상용화하고 있는 생명분자를 위한 건강 연구소(Knowledge for Health Institute for Biomolecules)의 설립자 중 한 명입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC 21974069)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 또한 세포 분석 연구소, 심천 베이 연구소, 중국으로부터 지원을 받았다; 생물 의학 기능성 재료의 강소 협력 혁신 센터; 중국 난징 사범 대학의 생물 의학 재료의 장쑤성 핵심 실험실.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암모늄 아세테이트피셔 화학A/3446/50≥ 99%
CESI 8000 플러스 모세관 전기영동 시스템Sciex, 미국
원심분리기Eppendorf5406000097
원심 필터MerckUFC20102410 kDa 컷오프
중수소 산화물에너지 화학 E09000199.9 %
D 포름산Acros 유기물 
용융 실리카 유리 모세관Polymicro Technologies1068150017ID 50μ m, OD 360μ m
가스 크로마토 그래애질런GC6890N
염산시그마 알드리치258148
히드 록시 프로필 셀룰로오스알라딘H113415MW 100000
자석 교반기DLAB8030101212
메탄올피셔 화학 A456-4MS 등급
마이크로 볼륨 UV-Vis 분광 광도계DeNovix84677JK7731
미오글로빈시그마 AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기Thermo Fisher Scientific, 미국
PA 800 Plus 제약 분석 CE 시스템Beckman Coulter, 미국
Q Exactive UHMR 질량 분석기Thermo Fisher Scientific, 독일
나트륨  수산화물시그마 AldrichS5881
유비퀴틴시그마 AldrichU6253
초음파 발생기SCIENTZSB-5200
β-락토글로불린시그마 AldrichL0130
270480250피, 트 , , ,

참고문헌

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