모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

Lingxiao Chaihu; Xiaopeng Yao; Xiang Xu; Zhongqin Zhu; David D. Y. Chen; Guanbo Wang

doi:10.3791/62672

방법 논문

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

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DOI:

10.3791/62672

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2021년 6월 8일

Lingxiao Chaihu¹^,² , Xiaopeng Yao¹ , Xiang Xu¹^,² , Zhongqin Zhu¹ , David D. Y. Chen³ , Guanbo Wang¹

¹School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, ²Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, ³Department of Chemistry, University of British Columbia

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.

초록

용액 중에 공존하는 다중 단백질 상태의 형태적 이질성을 해결하는 것은 단백질 치료제의 특성화와 분자 인식에서 효소적 촉매에 이르기까지 생물학적 기능에 중요한 형태적 전이 경로의 결정에서 주요 장애물 중 하나로 남아 있다. 하향식 질량 분광법(MS) 분석과 결합된 수소/중수소 교환(HDX) 반응은 단백질 고차 구조 및 역학을 순응자 특유의 방식으로 특성화하는 수단을 제공합니다. 이 기술의 형태적 분해능은 무손상 단백질 수준에서 단백질 상태를 분리하고 HDX 반응 동안 잔류 비중수소화 양성자성 함량을 최소화하는 효율성에 크게 의존합니다.

여기서는 형태 분해능을 향상시키는 것을 목표로 하는 HDX MS 접근법의 모세관 전기영동(CE) 기반 변이체를 설명한다. 이 접근법에서, 단백질은 모세관 전기영동 분리 동안 중수소화된 배경 전해질 용액(BGE)을 통해 이동하면서 HDX 반응을 겪는다. 용액 중에 공존하는 상이한 단백질 상태 또는 프로테오폼은 이들의 상이한 전하 대 크기 비율에 기초하여 효율적으로 분리될 수 있다. 단백질과 양성자성 용매 분자 사이의 전기영동 이동성의 차이는 잔류 비중수소화 용매를 최소화하여 HDX 공정 중에 거의 완전한 중수소화 환경을 초래합니다. 유동-관통 마이크로바이알 CE-MS 계면은 분무기의 출구에서 담금질 및 변성 개질제 용액과의 신속한 혼합에 이어 용출된 단백질 종의 효율적인 전기 분무 이온화를 허용한다. 온라인 하향식 MS 분석은 용출된 무손상 단백질 종의 글로벌 중수소 수준을 측정하고, 그 후 기상 단편의 중수소화를 측정합니다. 이 논문은 우유에 공존하는 천연 단백질 변이체를 포함한 시스템에 대한 차등 HDX에서 이러한 접근법을 보여줍니다.

서론

서로 다른 형태적, 결합 또는 변형 상태에서 단백질 종을 구별하고 구조적 차이를 특성화하는 것은 분자 인식에서 효소 촉매에 이르기까지 생물학적 사건에 관여하는 이들 종 간의 전이 경로를 모니터링하고 이러한 사건의 기초가되는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 종래의 생물물리학적 기술은 용액 중의 불충분한 분해능 및 동적 정보의 손실과 같은 한계로 인해 완전한 해결책을 제공하지 못한다. 질량 분광법 (HDX MS)과 결합 된 수소 / 중수소 교환은 단백질의 불안정한 수소 원자와 의도적으로 도입 된 ^2H2O용액의 2H 사이의 교환을 통해 중수소 (^2H)로 단백질의 구조적 및 형태적 특징을 표시하는 기술입니다. 수소 결합에 관여하거나 단백질 내부의 용매로부터 격리되는 양성자는 쉽게 교환되지 않는다¹. 따라서, 교환 가능한 부위에서의 환율이 고차 구조에서의 그의 관여에 크게 의존함에 따라, 단백질 구조는 ^1H와 2H 사이의 상이한 원자 질량에 기초하여 ^2H-흡수의 ^{범위와 속도를}조사하는 MS에 의해 높은 공간 분해능에서 드러날 수 있다. 최근 수십 년 동안 HDX MS는 단백질 형태 및 역학^....