생체 내 피내 칸디다 알비칸스 감염에서 Th17 면역을 유도하기 위한 피부 수지상 세포의 차등 부분 집합의 기능

요약

여기에서는 심부 진피 칸디다 알비칸스 감염의 Th17 면역에서 피부 수지상 세포 부분 집합의 생체 내 기능을 입증합니다.

초록

피부는 신체의 가장 바깥쪽에 있는 장벽 기관으로, 전문 항원 제시 세포 그룹인 여러 유형의 수지상 세포(DC)를 포함합니다. 피부가 침입하는 병원체를 만나면 서로 다른 피부 DC가 신체를 보호하기 위해 뚜렷한 T 세포 면역 반응을 시작합니다. 침입하는 병원체 중 진균 감염은 특이적으로 보호용 인터루킨-17 생성 Th17 면역 반응을 유도합니다. Th17 면역을 유도하는 피부 DC의 하위 집합을 조사하기 위해 피내 칸디다 알비칸스 감염에 의해 Th17 세포를 효율적으로 구별하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 유세포 분석 및 유전자 발현 분석은 피부 배출 림프절과 감염된 피부에서 Th17 면역 반응의 두드러진 유도를 밝혔습니다. 디프테리아 독소 유도 DC 하위 집합 고갈 마우스 균주를 사용하여 CD301b⁺ 피부 DC는 이 모델에서 최적의 Th17 분화를 장착하는 책임이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 이 프로토콜은 피부 심부 진균 감염에 대한 Th17 면역을 결정하기 위해 피부 DC의 차등 하위 집합의 생체 내 기능을 연구하는 귀중한 방법을 제공합니다.

서론

피부는 가장 바깥쪽에 있는 장벽 기관으로 외부 병원체의 침입과 자극으로부터 신체를 보호합니다¹. 피부는 각질세포의 성층 상피인 표피(epidermis)와 콜라겐 및 기타 구조적 구성 요소의 조밀한 네트워크인 진피(dermis)를 포함하여 두 개의 뚜렷한 층으로 구성되어 있습니다. 피부는 일차 상피 장벽 조직으로서 주로 물리적 장벽을 제공하고 수많은 상주 면역 세포를 포함하고 있기 때문에 추가적인 면역 장벽에 기여합니다 ^2,3. 피부 면역 세포 중 수지상 세포(DC)는 전문 항원 제시 세포의 일종으로, 자가 및 비자가 항원을 적극적으로 흡수하고 국소 림프절(LN)로 이동하여 항원의 특성에 따라 항원 특이적 T 세포 반응 및 내성을 시작합니다⁴.

피부에는 표피 항원 제시 세포, 즉 랑게르한스 세포(LC)와 피부 유형 1 기존 DC(cDC1) 및 피부 유형 2 기존 DC(cDC2)를 포함한 최소 두 가지 유형의 DC가 있습니다⁵. 표피 LC는 배아 단핵구에서 유래하며 항상성 조건 하에서 자가 영속을 통해 세포 수를 유지합니다⁶. 이와는 대조적으로, 진피 cDC1 및 cDC2는 조혈모세포에서 유래하였으며 DC에 의해 투입된 전구 세포에 의해 지속적으로 보충됩니다⁵. 피부 DC는 표면 마커가 특징이며, 크게 Langerin⁺(LC 및 cDC1 포함)와 CD11b⁺Langerin^- 개체군(주로 cDC2)으로 나뉩니다. 또한, 이 그룹은 CD11b⁺Langerin-DC 집단이 CD301b 발현⁷에 따라 두 개의 하위 집합으로 더 분류됨을 밝혔습니다.

피부 DC의 중요한 기능적 특징은 주로 DC의 각 하위 집합의 내재적 특성, DC의 현장 위치, 조직 미세환경 및 국소 염증 신호에 의해 결정되는 분업에 중점을 둡니다⁸. 피부 DC의 이러한 기능적 특성은 피부의 특정 유형의 면역 반응 동안 DC의 특정 하위 집합의 역할에 대한 조사를 필요로 합니다. 배출 LN에서 피부 DC에 의한 항원 자극에 의해, naive CD4⁺ T cell은 helper T cell의 특정 subset으로 분화하여, effector 기능을 발휘하기 위해 정의된 cytokine 세트를 생성합니다⁹. CD4⁺ 보조 T 세포 하위 집합 중 인터루킨-17(IL-17)을 생성하는 Th17 세포는 자가면역 질환 및 항진균 면역에 중요한 역할을 합니다¹⁰. 이와 관련하여, 피부 진균 감염은 in vivo 11,12,13에서 Th17 면역을 연구하기 위한 강력한 모델이었습니다. 테이프를 벗긴 피부가 칸디다 알비칸스(C. albicans) 효모에 피외로 노출되면 표피 LC는 항원 특이적 Th17 분화를 촉진하는 데 중추적인 역할을 합니다¹⁴.

피내 C. 알비칸스(C. albicans) 감염에 대한 보호 면역을 위해서는 섬유아세포와 식세포의 섬유소 용해 활성과 같은 선천성 면역이 필요하다¹⁵. 그러나 심부 피부 C. albicans 감염에서 Th17 면역을 확립하는 데 있어 피부 DC 부분 집합의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 논문은 국소 및 국소 Th17 면역 반응을 생성하는 C. albicans의 피내 피부 감염 방법을 설명합니다. 디프테리아 독소(DT)에 의한 DC 서브셋 고갈 마우스 균주를 적용한 결과, CD301b⁺ 피부 DC가 이 모델에서 Th17 면역에 결정적인 것으로 나타났습니다. 여기에 설명된 접근 방식은 깊은 피부 침습성 진균 감염에 대한 Th17 반응을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC, 승인 ID: 2019-0056, 2019-0055)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 체중이 18-24g인 7-9주 된 야생형(WT) C57BL/6 암컷 마우스가 사용되었습니다. 일부 연구는 같은 연령과 체중의 암컷 Langerin-diphtheria 독소 수용체(DTR)와 CD301b-DTR 마우스를 사용하여 수행되었습니다. 실험을 위해 각 그룹에서 4-6 개의 마우스가 사용되었으며, 데이터는 3 개의 독립적 인 실험을 대표합니다. 이 작업은 생물 안전 레벨 3 조건에서 수행되었으며, 기관 지침에 따라 생물 안전성 레벨 2 조건(실온 23°C ± 3°C, 습도 50% ± 10%)에서도 수행할 수 있습니다.

1. 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 준비

참고: 이 섹션의 실험은 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다.

1. 접종 루프와 바늘을 사용하여 효모-펩톤-덱스트로오스-아데닌(YPDA) 한천 플레이트에 C. albicans 균주 SC5314를 줄무늬 넣습니다.
2. 플레이트를 30 ° C에서 2 일 동안 거꾸로 배양합니다.
   참고: C. albicans가 함유된 YPDA 한천 플레이트는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
3. 멸균 피펫 팁을 사용하여 50mL 튜브에 10mL의 YPDA 배지를 접종하기 위해 플레이트에서 단일 콜로니를 분리합니다.
4. 30 ° C에서 230-250 rpm으로 흔들어 ~ 17 시간 동안 배양합니다.
5. 효모 현탁액을 큐벳에 놓고 OD₆₀₀ 이 1.5-2.0에 도달할 때까지 UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 300분마다 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
   참고: 이 단계는 16-18시간이 소요될 수 있습니다.
6. 효모 현탁액을 1000 × g 에서 5분 동안 회전시킵니다.
7. 상등액을 버리고 효모 세포를 적절한 양의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
8. 혈구계를 사용하여 C. albicans 세포를 계수하고 현탁액을 1000 ×g 에서 5분 동안 회전시킵니다.
9. 상층액을 버리고 PBS의 C. albicans 세포를 발패드당 40μL의 PBS에서 1 × 10⁷ 세포의 농도로 재현탁합니다.
10. heat killed(HK) C. albicans를 준비하려면 세포 수를 결정한 후 가열 믹서를 사용하여 65°C에서 60분 동안 가열하여 효모 세포를 죽입니다.

2. C. albicans에 의한 쥐 발바닥 감염

그림 1: 피내 칸디다 알비칸스 감염 모델의 개략도. (A) 마우스의 뒷발판에 1 × 10⁷ C. 알비칸스를 피내 주입했습니다. 7일 후, 마우스의 발바닥을 피내 주사로 1 × 10⁷ HK C. albicans에 재노출시켰고, 항원 챌린지 후 24시간 후에 지연형 과민 반응을 측정했습니다. C. albicans 감작 중 국소 면역 반응은 피부 배출 LN에서 7일 후 분석되었습니다. (B, C) C. albicans 를 피내 발패드 주사 전 발판 이미지.(디, 이) C. albicans를 오른쪽 발바닥의 깊은 진피에 주입합니다. (여, 지) 오른쪽 발판의 발판 주사 후 발적 및 부기의 임상 징후. (H) C. albicans 주사 후 발바닥에서 슬와골 LN까지의 림프 경로를 보여주는 스케치. (I) C. albicans 주사 후 7일 후 및 (J) 주사 없이 무릎 뒤에 위치한 노출된 슬와골 LNs. 약어: HK = heat-killed; LN = 림프절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 마우스의 호흡 속도가 느려지고 발가락이나 꼬리 꼬집음에 대한 금단 반응을 보이지 않을 때까지 유도 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
   참고: 마취 중에는 안구 건조증을 예방하기 위해, 특히 5분 이상 지속되는 마취의 경우 안연고를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 31G 바늘의 캡을 제거하고 세포를 혼합한 후 1.9단계에서 준비된 C. albicans 와 함께 0.3mL 인슐린 주사기를 로드합니다.
3. 유도 챔버에서 마취된 마우스를 제거하고 40μL의 효모 세포(1 × 10⁷ 개 세포)를 오른쪽 발바닥의 깊은 진피에 부드럽게 주입하여 C. albicans 감작을 돕습니다.
   참고: 풋패드에 주입할 수 있는 최대 부피는 50μL입니다.
4. 주사기 바늘을 주사 부위에서 천천히 빼냅니다.
5. 마취에서 완전히 회복될 때까지 각 마우스를 케이지에 혼자 두었다가 안전하게 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다.
6. C. albicans에 대한 항원 특이적 반응을 개발하기 위해, 앞서 설명한 바와 같이 감작 후 7일 후에 피내 주사를 통해 준비된 HK C. albicans로 마우스의 오른쪽 발판에 이의를 제기합니다(1 × 10⁷ 세포; 발바닥당 40 μL, 2.1-2.5 단계 반복).
7. CO₂ 챔버에서 안락사 후 항원 챌린지 후 24시간 후 C. albicans 감작 후 7일 후에 피부 배출 LN 또는 병변 발패드 조직을 수확합니다.

3. 생체 내 디프테리아 독소 유도 수지상 세포 고갈

참고: 이 연구에서 Langerin-DTR 및 CD301b-DTR 마우스는 모두 C. albicans에 대한 피내 감작 1일 전후에 DT 치료를 받았습니다.

1. PBS에서 10μg/mL의 DT 용액을 준비합니다.
2. 1mL 인슐린 주사기의 바늘에서 캡을 제거하고 DT를 혼합한 다음 주사기에 DT를 채웁니다.
3. 머리를 숙인 자세로 마우스를 적절하게 구속하십시오.
4. 생쥐의 복부 쪽을 70% 에탄올로 소독합니다.
5. 각 마우스에 100μL의 1μg DT를 복강내로 천천히 주입하여 특정 수지상 세포 하위 집합을 고갈시킵니다.
   알림: 주사 중 장기가 손상되지 않도록 주의하십시오.
6. 5초 동안 기다립니다. 그런 다음 천천히 바늘을 제거하십시오.

4. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응

1. 호흡 움직임이 관찰되지 않을 때까지 마우스를 CO₂ 챔버에 놓습니다.
2. 70% 에탄올로 마우스를 소독하고 집게와 가위를 사용하여 뒷발 패드 피부의 병변을 작은 조각으로 자릅니다.
3. 얇게 썬 조직을 RNA 분리 시약에 완전히 담그십시오.
4. 제조업체의 지침에 따라 조직 균질기를 사용하여 샘플을 균질화합니다(30Hz에서 3분씩 2사이클).
   참고: 이 연구에서는 조직 용해에 스테인리스 스틸 비드가 사용되었습니다.
5. 10,000 × g 에서 5분, 4 °C로 회전합니다.
6. 상등액을 새 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
7. total RNA isolation kit를 사용하여 병변 피부에서 total RNA를 분리합니다.
8. UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.
9. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)을 위한 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
10. 녹색 형광 염료를 사용하여 PCR 주기 동안 이중 가닥 DNA의 합성을 모니터링하여 Real-Time PCR 시스템으로 Real-Time qPCR을 수행합니다.
    참고: 이 연구에서 결과는 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실전이효소(Hprt) 수준으로 정규화되었습니다. 프라이머 서열은 표 1에 열거되어 있으며, PCR 프로토콜은 다음과 같습니다 : 95 °C에서 30 초 동안 초기 변성, 42 사이클 (95 ° C 5 초, 60 ° C 30 초)에 대한 증폭.

5. 세포 분리 및 유세포 분석

1. CO₂ 안락사 후 집게와 가위를 사용하여 쥐를 해부하고 무릎 뒤에 위치한 슬와골 LN이라고 하는 발바닥 배수 LN을 조심스럽게 노출시키고 수확합니다.
2. 3mL 주사기의 플런저를 사용하여 균질화 후 70μm 스트레이너를 통해 조직을 여과하여 각 마우스의 발패드 배출 LN에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
3. PBS로 세포를 세척하고 500 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전합니다.
4. 상층액을 버리고 PBS로 세포를 다시 씻으십시오.
5. 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 회전합니다.
6. 상등액을 버리고 T 세포 자극을 위한 24 웰 플레이트에 55μM β-메르캅토에탄올, 50ng/mL 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 500ng/mL 이오노마이신을 함유한 완전한 RPMI-10 배지에 세포를 재현탁합니다.
7. 1시간 후 10μg/mL의 브레펠딘 A와 1000x 모넨신을 세포 현탁액에 첨가하고 추가로 5시간 동안 배양합니다.
8. 세포를 채취하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액으로 세척합니다.
9. 500 ° C에서 5 분 동안 4 × g 에서 회전하고 상층액을 버립니다.
10. 고착성 사세포 염색 염료로 죽은 세포를 염색하고 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
11. FACS 버퍼로 샘플을 세척하고 500 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전시킵니다.
12. 상등액을 버리고 형광색소 접합 표면 마커 항체와 Fc 수용체 차단제로 세포를 4°C에서 30분 동안 염색합니다.
13. FACS 버퍼로 샘플을 세척하고 4°C에서 5 분 동안 500×g으로 회전시킵니다.
14. 상등액을 버리고 세포 내 염색을 위해 4°C에서 15-20분 동안 고정 및 투과화 용액에 펠릿화된 세포를 재현탁합니다.
15. 1x 세척 버퍼로 샘플을 세척하고 500 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전시킵니다.
16. 상등액을 버리고 4°C에서 30분간 세포내 사이토카인 염색을 실시합니다.
17. 1x 세척 버퍼로 샘플을 세척하고 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 회전합니다.
18. 적절한 부피(200-300μL)의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
19. 유세포 분석을 사용하여 단백질 발현을 분석합니다.

결과

여기에서는 생체 내에서 피부 DC 매개 Th17 면역 반응의 역할을 연구하기 위해 C. albicans의 피내 감염 모델을 시연했습니다. C. albicans를 발바닥에 초기 피내 주사한 후, 피부 배출 LN을 확대했습니다(그림 2A). 감작 기간 동안 CD4⁺ 대 CD8⁺ effector T 세포의 비율이 현저하게 증가했습니다(그림 2B,C). 또한, 효과기 CD4⁺ T 세포는 효과기 CD8⁺ T 세포에 비해 IL-17A를 풍부하게 생성했습니다(그림 2D, E). 이러한 결과는 피내 C. 알비칸스 감염이 IL-17A 생산 CD4⁺ T 세포 면역을 강...

토론

이 논문은 in vivo에서 Th17 면역 반응에서 피부 DCs의 역할을 연구할 수 있는 피내 C. albicans 감염 방법을 설명합니다. DT 유도 마우스 균주와 함께 다파라메트릭 유세포 분석을 적용함으로써 CD301b⁺ 피부 DC가 심부 피부 C. 알비칸스 감염에 대한 Th17 면역을 시작하는 데 중요한 피부 DC 하위 집합임을 발견했습니다. 더욱이, 그 결과, IL-17 생성 T 세포 반응은 주로 CD4⁺에 의해 생성되지만 CD8⁺ T 세포에 의해 생성되지 않음을 보여주었으며, 이는 이 모델이 생체 내 Th17 면역의 충실한 모델임을 나타냅니다.

이전의 우아한 연구는 표피 C. albicans 감염이 IL-6 생성 표피 LC를 통해 Th17 면역을 유도한다는 것을 보여주었습니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.3 mL (31 G) 인슐린 주사기	BD	328822
1x  펌/워시 버퍼	BD	554723
1 mL (30 G) 주사기 인슐린 주사기	BD	328818
24 웰 플레이트	Falcon	353047
50 mL 원추형 튜브	Falcon	50050
70 μ m 스트레이너	Falcon	352350
70% 에탄올
ABI StepOnePlus 실시간 PCR 시스템	Applied Biosystems
마취실	하버드 장치
Brefeldin A	BD	BD 555029
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Candida	피츠버그 대학의 다니엘 카플란(Daniel Kaplan)이 제공한
CD3	BioLegend	100216	Clone 17A2
CD301b-DTR 마우스			예일 대학의 Akiko Iwasaki가 제공한
CD4	BioLegend	100408	Clone GK1.5
CD44	eBioscience	47-0441-80	Clone IM7
CD8a	BD Biosciences	553031	Clone 53.6.7
Centrifuge
Clicker counter
Cuvette	Kartell	KA.1938
Cytofix/Cytoperm 용액	BD	554722
디프테리아 독소(DT)	Sigma
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)	Welgene	LB001-02
FACS(형광 활성화 세포 분류) 완충액	사내
Fc 수용체 차단제	BD	553142
소 태아 혈청(FBS)	Welgene	S101-07
포셉스	채취용	Roboz
혈구계	Fisher Scientific	267110
Hybrid-R total RNA kit	GeneAll Biotechnology	305-101
하이드록시에틸 피페라진 에탄 설폰산(HEPES)	Gibco	15630-080
IL-17A(세포 내 사이토카인)	BioLegend	506912	Clone TC11-18H10.1
Ionomycin	Sigma	I0634
Isoflurane
Langerin-DTR			제공: 이흥규 한국과학기술원(Korea Advanced Institute of Science and
Technology) LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
Loop and Needle	SPL	90010
Monensin	BD	BD554724
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Penicillin	Gibco	15140-122
페트리 접시	SPL	10090
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P8139
PrimeScript RT 마스터 믹스	Takara Bio	RR360A
RPMI 1640	Gibco	11875-093
샘플 수확용	가위	Roboz
스테인리스 스틸 비드, 5mm	QIAGEN	69989
멸균 피펫 팁
SYBR Green Premix Ex Taq II	Takara Bio	RR820A
TCRβ	BioLegend	109228	클론 H57-597
ThermoMixer  C	Eppendorf
TissueLyser	QIAGEN
UV-VIS 분광 광도계	PerkinElmer
Wild-type C57BL/6  생쥐	오리엔트 바이오		7-9주 된 생쥐는
효모-펩톤-덱스트로오스-아데닌(YPDA) 배지, 액체, 멸균(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 2% 포도당)
YPDA 한천 플레이트, 멸균(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 2% 포도당, 2% 박토 한천)을 사용했습니다.